电针委中穴对腰椎退变大鼠腰椎间盘中NFAT5表达的影响

朱杭 陶其杰 林士明 唐成坤 潘浩

随着人们劳动方式和生活方式的改变,椎间盘退变的发病率逐年上升,呈现年轻化趋势[1].据统计由腰椎间盘退变引起的腰痛患者占门诊的60%~80%,其中约11%~12%的患者生活质量受到严重影响[2-3],防治腰痛、延缓椎间盘退变逐年受到重视.近年来,有学者发现渗透压与椎间盘退变过程有紧密联系,维持渗透压平衡在缓解椎间盘退变中维持着重要作用.目前已知电针在防治腰椎间盘退变引起的腰痛中有较好疗效,对其延缓退变和缓解疼痛的机制也有一定了解[4-7].故本研究通过制作去双前肢诱导直立大鼠模型,模拟人椎间盘的自然退变过程,观察电针委中穴对模型大鼠腰椎间盘组织中渗透压核转录因子5(NFAT5)表达变化,探讨委中穴在防治腰椎间盘退行性变的可能机制.

1 材料与方法

1.1 动物与分组 选用正常离乳SD大鼠(3周龄)32只,雌雄不限,由浙江中医药大学实验动物中心提供.在标准条件下常规饲养1周后,按随机数字表法分为正常组、模型组、电针委中穴组、电针非穴组,每组各8只.

1.2 实验设备和实验试剂 选用低温离心机、金属恒温箱、正置光学显微镜、成像系统(日本尼康);石蜡包埋机、病理切片机、烤片机(武汉俊杰);酶标仪(美国 TEK-BIO 仪器厂);普通PCR仪(ABI 公司)、华佗牌G6805电针仪(苏州产); Trizol裂解缓冲液(北京鼎国);甲酰胺(Sigma 公司),溴乙锭(Sigma 公司),焦碳酸二乙酯(DEPC,Sigma 公司);OligoDNA引物合成(委托北京鼎国生物技术有限责任公司合成);阿利新蓝染色液(武汉谷歌生物)等.

1.3 去双前肢诱导直立大鼠模型的建立 参照Liang'等[8]的方法制作去双前肢诱导直立大鼠模型(以下简称双足鼠).除空白组外余下24只大鼠按35mg/kg给予3%浓度戊巴比妥钠,进行麻醉后,随后予以腋下备皮、碘伏消毒,取上臂中上1/3 处横向切开皮肤,逐层剥离,暴露三角肌下血管神经束,予以丝线结扎,再用组织剪剪断肌肉、血管和神经,用咬骨钳咬断肱骨,碘伏擦拭后逐层缝合.整个实验过程在(37±0.5)℃的温度下进行,术后4-0丝线逐层缝合.并给予抗炎药物肌肉注射.术后置于特制饲养笼内,食物及饮水装置放于鼠直立位可触及高度,同期选取大小合适的特制塑料管,将双足鼠放置于管中使其被迫站立,10h/d.

1.4 各组处理方法 到达造模周期后随机抽取双足鼠与空白组大鼠各一只,分别处死取腰椎间盘组织行阿尔新蓝染色,确认造模是否成功.造模成功后模型组、电针委中穴组、电针非穴组共21只造模大鼠,每组各7只.空白组:饲养在特制鼠笼,无特殊处理;模型组:建立双足鼠模型,不予电针处理.电针组:于造模成功后第1天开始行电针治疗30min/(次.d),连续治疗15d.治疗方法:定位参照李忠仁主编《实验针灸学》[9],取大鼠双侧委中穴,予以剪毛,助手拉直大鼠的膝关节,运用双极联体针[10]直刺0.3cm,快速提插捻转至针下有沉涩感后,接通SDZ-II型华佗牌电针治疗仪,参数为疏密波,2Hz/15Hz,刺激强度为1~2mA,针刺强度以部位轻微抖动为宜,30min/(次.d),连续治疗15d;非穴组的对照点设在委中穴内侧旁开0.3cm,余治疗同委中穴组.

1.5 观察指标及检测方法 治疗周期结束后,根据大鼠体重按35mg/kg给予3%浓度戊巴比妥钠予以麻醉,取出L1-L5脊椎置于冰上进行操作,快速取出对应椎间盘,经PBS冲洗后,放置在预冷的4℃4%多聚甲醛中,固定24h.NFAT5及有机渗透转运蛋白mRNA表达检测:从GenBank获取目的基因mRNA的全长序列,利用引物和探针设计软件Primer 5.0设计引物序列.经Blast分析,引物序列都具有特异性.所用的引物及内参照β-actin引物(引物均委托北京鼎国生物技术有限责任公司合成)所示:

目的基因 引物序列NFAT5 5'-CGACAGTGCCAAAGCACCTC-3'5'-AACCGGATACTGTCCACACAACAT-3'BGT 1 5'-GACAAGGACCAGGTGAAGGAT -3'5'-AGGCAAGGATGATGATFTAGTAGA-3'TauT 5'-GCGGTGATAACTTATATGACGGTAT-3'5'-GGCAGAGGAGGATGACAATGA-3'AR 5'-TTTCCTTCTTTCTTTTTCTTCTTCT-3'5'-GGTTTTTTTACTCTCTCTGTTTGTT-3'β-actin 5'-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3'5'-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3'

取腰椎间盘组织,采用Trizol法提取总RNA,完成后定量.实时定量PCR 反应条件:95℃、30s,95℃、30s,60℃、34s,共进行45个循环.以β-actin作为内参照.实验结果以ABI 7500软件进行分析.其相对定量值使用比较Ct法进行计算,计算公式为.

1.6 统计学方法 采用SPSS18.0统计软件.计量资料以(±s)表示,组间比较若满足正态性且方差齐时采用单因素方差分析LSD法和SNK法,方差不齐时选择Tamhane T2和DunnettT3法进行方差检验和两两比较,若不满足正态性时采用秩和检验.P<0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 椎间盘组织病理学变化 术后4个月,分别随机选取1只双足鼠和1只正常组大鼠,予以腹腔麻醉后取腰椎间盘行阿尔新蓝染色能与蛋白多糖结合呈现蓝色,骨组织不着色.正常组(见图1A),镜下可见椎间盘中央完整的髓核和纤维环结构清晰、层次分明,与髓核界线清楚,髓核内有丰富的空泡细胞和小的类软骨样细胞,髓核内细胞聚集在其中,整体髓核组织染色较深.模型组(见图1B):椎间盘纤维环排列紊乱甚至断裂,髓核缩小,髓核内网格样结构消失,髓核和纤维环界线不清,整体椎间盘组织染色较淡.提示本次造模成功.

图1 大鼠腰椎间盘组织结构观察

2.2 各组大鼠椎间盘组织中NFAT5、TauT、AR及BGT1 mRNA表达情况 Real-Time PCR结果显示:与正常组比较,模型组椎间盘内NFAT5、BGT1、AR及TauT mRNA表达含量显著减少,差异具有统计学意义(P<0.05), 且 NFAT5及 BGT1、TauT、AR mRNA呈现正向关系;与模型组比较,电针组NFAT5 mRNA表达含量均有上升,其中电针委中穴组升高更为明显(P<0.05),电针非穴组虽有表达,但差异无统计学意义(P>0.05);NFAT5及 BGT1、TauT、AR mRNA在电针委中穴与电针非穴组中均有表达,但前者较后者显著(P<0.05)(见表1、2).

表1 椎间盘退变后各组大鼠NFAT5 mRNA的表达情况(±s)

表1 椎间盘退变后各组大鼠NFAT5 mRNA的表达情况(±s)

注:与正常组比较,*P<0.01,#P<0.05;与模型组比较,△P<0.05;与电针委中穴比较,◇P<0.05

组别 数量(只) NFAT5含量正常组 7 1.29±0.207模型组 7 0.78±0.185*电针委中穴组 7 1.06±0.164#△电针非穴组 7 0.85±0.193*◇

表2 各组大鼠椎间盘内BGT1、TauT、AR mRNA的表达情况(±s)

表2 各组大鼠椎间盘内BGT1、TauT、AR mRNA的表达情况(±s)

注:与正常组比较,*P<0.01,#P<0.05;与模型组比较,▲P<0.01,△P<0.05;与电针委中穴比较,◇P<0.05

组别 数量(只) BGT1 mRNA TauT mRNA AR mRNA正常组 7 1.04±0.099 0.99±0.246 1.13±0.132模型组 7 0.67±0.140* 0.44±0.173* 0.48±0.158*电针委中穴组 7 0.86±0.198#△ 0.72±0.202#△ 0.66±0.122*▲电针非穴组 7 0.70±0.059*◇ 0.49±0.130*◇ 0.51±0.143*◇

3 讨论

普遍认为腰椎间盘退行性变是直接产生腰痛的主要原因.祖国医学尚无"腰椎间盘退变"的诊断,通过结合患者临床症状可以归为"痹症"、"腰痛"范畴.委中穴是治疗腰椎退变疾病的常用穴位,《乾坤生意》记载:"腰背委中求",是对其主治作用的经典概括.委中穴又名"血郄"、"郄中"等,属于足太阳膀胱经的合穴.白亚楠等[11]通过收集27部古籍中治疗腰痛病案并进行汇总,发现委中穴使用频次最多,达25次.现代医学发现:支配委中穴的传入神经投射到脊髓的节段与腰背部神经节段的分布在后根神经节与脊髓存在部分重叠,在神经解剖学上得到客观论证.近年来,国内外学者从炎症反应、局部血流、神经再生、疼痛物质改变和肌纤维修复等多方向进行相关研究[4-7],使委中穴防治腰椎间盘退变疾病的机制有了深一步的了解.

NFAT5作为Rel蛋白家族之一,有与NFAT家族相似的序列,也是目前唯一已知在哺乳动物体内由渗透压激活的转录因子,通常分布于肾脏、关节、晶状体、椎间盘等已知的高渗组织中.高渗刺激下,磷酸化的NFAT5进入胞核进行核易位、活性转录调节及NFAT5合成三步骤,通过自身调控使细胞发生了一系列适应性改变以防止其结构和功能产生损害.另外,通过结合渗透转运体的TonE/ORE序列调控转运蛋白包括牛磺酸转运蛋白(TauT)、醛糖还原酶(aldose reductase,AR)、钠离子三甲铵乙内酯(BGT-1)形成,促进有机渗透物质入胞内,平衡内环境.研究发现髓核细胞所生长的环境是一个偏向低氧、低PH及高渗的生态龛.高渗环境可以促使髓核组织在高载荷作用下维持对水分子的吸附力,椎间盘组织通过利用髓核组织自身生理特点和调节胞外基质的水合状态从而达到承载日常脊柱压力,分散载荷.然而随着人体姿势的改变,椎间盘组织承受体重和肌肉不同因素的联合作用,椎间盘内水合状态时刻发生改变,昼夜渗透压发生改变,使得髓核细胞内环境紊乱,从而影响细胞结构和功能产生损害,造成椎间盘退行性变.本次实验显示空白组中的NFAT5表达含量明显高于模型组(P<0.05),说明NFAT5是正常椎间盘渗透环境中髓核细胞存活和功能所必需的渗透转录因子,调节参与基质稳态以响应渗透压的改变;AR负责催化山梨醇的生成、TauT及BGT1则分别负责有机渗透物质牛磺酸和甜菜碱的积聚[12],有机渗透物可以保护生物分子免受由渗透压和脱水改变引起的损害,从而提供细胞保护和抗炎作用.实验中AR及TauT、BGT1mRNA表达量的显著升高,提示渗透转运蛋白对维持髓核细胞内外的渗透压平衡起到一定促进作用.椎间盘退变常伴随渗透压的下降,所处的低渗环境可能影响NFAT5的表达,与本次结果相符.

本次实验造模选用的去双前肢诱导大鼠直立模型是目前国际上公认的造模方法,与空白组比较,模型组椎间盘纤维环排列紊乱甚至断裂,髓核缩小,髓核内网格样结构消失,髓核和纤维环界线不清,整体椎间盘组织染色较淡.提示双足鼠造模虽然耗时较久,但相较于其他造模法,更符合人类脊柱的运动学及生物力学特点.实验中模型组的NFAT5及渗透转运蛋白(AR、BGT-1、TauT)表达较电针委中穴组呈下降趋势(P<0.01),作者推测委中穴能够正向调节NFAT5表达,达到维持椎间盘内环境平衡.与电针非穴组比较,委中穴的NFAT5及AR、BGT-1、TauT含量增高,差异具有统计学意义(P<0.05),提示委中穴组与非穴组两者之间的存在差异性,可能与经穴自身结构特异性相关,也说明经穴与非经穴两者间在疗效特异性上存在一定差异.