白藜芦醇对低分化肝癌细胞Hep3B 增殖凋亡的影响

刘晋芳，徐慧超，高 艳，苗宇船，周儒奎

（山西中医药大学，山西 晋中030619）

肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率都位居世界前列，其中尤以低分化的肝癌患者死亡率较高［1-3］。近年来，随着细胞生物学技术的不断发展，对于肝癌细胞的增殖、细胞周期、凋亡、免疫逃逸、血管生长等生物学表型提出的靶向治疗，成为肝癌诊断治疗的重点［4-5］。白藜芦醇（Resveratrol，Res）是一种非黄酮类的多酚化合物，广泛存在于虎杖、葡萄等植物中，它可以抗炎、抗氧化、保护肝脏、减轻药物和酒精等引起的肝中毒，还具有抗肿瘤的生物活性，并且具有低毒性，可通过抑制DNA 聚合酶，从根本上降低DNA的合成能力，从而抑制细胞的增殖［6-7］。因此，它被认为是一种非常有效的肿瘤治疗药物。目前关于Res 对肝癌细胞Hep3B 的毒性、凋亡、周期、迁徙及侵袭等恶性生物学表型的影响鲜有报道。为进一步观察Res 对肝癌细胞Hep3B 的抗癌作用，本实验从Res 对肝癌细胞Hep3 增殖能力和凋亡能力的影响展开研究，为肝癌治疗的新靶向药物的研发奠定理论与实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

肝癌细胞株Hep3B 购自中国上海科学院细胞培养中心。RPMI 1640 培养基购于Hyclone 公司，双抗、胎牛血清、CCK-8 试剂盒、细胞周期检测试剂盒、Annexin V-FITC 凋亡检测试剂、胰酶购自中国南京凯基生物公司；Res 购自美国Selleck Chemicals 公司；多功能酶标仪购自美国Thermo Scientific 公司；倒置显微镜购自日本Olympus 公司；流式细胞仪购自美国Thermo Scientific 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 用含10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素和100 mg/mL 链霉素双抗的RPMI 1640，基于恒温37 ℃、5% CO2、饱和湿度的环境下培养肝癌细胞株Hep3B，当细胞融合度达80%时进行传代。

1.2.2 细胞增殖能力检测 细胞传代后过夜，分别用Res（0、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L）处理24 h，后将其消化、吹打并计数，铺于96 孔板中（每孔约2000 个细胞），孵育24 h、48 h 和72 h后于各孔中加入10 μL CCK-8 溶液，将96 孔板放入孵箱孵育2 h，用酶标仪在450 nm 处检测吸光度（OD）值，计算其相应的细胞活力，并计算出其IC50。

1.2.3 细胞周期检测 不同浓度的Res（0、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L）处理细胞48 h 后，将其消化、吹打、计数，PBS 清洗1 次，加入适量无水乙醇，4 ℃过夜固定；收集细胞，PBS 清洗3 次，加入100 μL 的RNase，37 ℃孵育1 h，加入50 μg/mL PI，4 ℃反应30 min，300 目滤网过滤后，流式细胞仪检测细胞周期的变化。

1.2.4 细胞凋亡检测 不同浓度的Res（0、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L）处理细胞48 h 后，胰酶消化并吹打，使样品的细胞浓度为1×106个/mL，PBS 清洗2 次，用500 mL 结合缓冲液悬孵细胞，加入5 μL Annexin V-FITC 混匀，再加入5 μL PI混匀；避光反应15 min，1 h 内使用流式细胞术检测细胞凋亡的变化。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0 统计学软件进行数据分析。数据用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD-t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Res 抑制肝癌细胞Hep3B 的增殖

随着Res 药物浓度的增加，Hep3B 细胞增殖抑制率在一定范围内显著增加，且呈浓度和时间依赖性（P＜0.05，P＜0.01）。肝癌细胞Hep3B 在Res 处理48 h 后，其半数致死浓度（Half maximal inhibitory concentration，IC50）约为40 μmol/L，为了进一步阐明Res 对肝癌细胞Hep3B 生物学表型的影响，后续实验均用Res 处理48 h 进行干预。结果见表1。

表1 Res 对肝癌细胞Hep3B 增殖能力的影响 （h，±s）

表1 Res 对肝癌细胞Hep3B 增殖能力的影响 （h，±s）

注：与空白对照组比较，1）P＜0.05，2）P＜0.01

组别 n 24h 48h 72h空白对照组 4 0.63±0.05 1.13±0.08 1.38±1.17 Res 组（20 μmol/L） 4 0.35±0.131） 0.82±0.041） 1.02±0.061）Res 组（40 μmol/L） 4 0.18±0.052） 0.54±0.022） 0.82±1.131）Res 组（80 μmol/L） 4 0.07±0.032） 0.18±1.212） 0.39±0.072）

2.2 Res 对肝癌细胞Hep3B 细胞周期和细胞凋亡的影响

将肝癌细胞Hep3B 用不同浓度的Res（0、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L）处理48 h 后，进行PI 染色，用流式细胞仪对细胞进行DNA 含量的测定，根据DNA 含量的分布情况，用Flow Jo 软件进行细胞周期分析。实验结果表明Res 处理后的肝癌细胞Hep3B 处于G1、S 期的细胞数较对照组减少，而处于G2/M 期的细胞数较对照组显著增多（P＜0.05），提示Res 对肝癌细胞Hep3B 具有周期阻滞效应。

将肝癌细胞Hep3B 用不同浓度的Res 处理48 h 后，应用Annexin V-FITC/PI 试剂盒染色，流式细胞分析软件Flow Jo 进行细胞凋亡分析。研究结果表明Res 处理后的肝癌细胞Hep3B 与对照组相比，细胞凋亡率显著增加（P＜0.05），提示Res 可促进肝癌细胞Hep3B 的凋亡。结果见表2。

表2 Res 对肝癌细胞Hep3B 细胞周期和细胞凋亡的影响（%，±s）

表2 Res 对肝癌细胞Hep3B 细胞周期和细胞凋亡的影响（%，±s）

注：与空白对照组比较，1）P＜0.05

组别 n G1 S G2/M 凋亡率（%）空白对照组 4 67.45±0.73 23.64±1.16 8.10±1.25 3.25±0.41 Res（20 μmol/L） 4 42.63±0.931） 43.24±0.07 14.13±0.761） 4.34±0.23 Res（40 μmol/L） 4 39.45±1.711） 38.19±0.53 22.36±0.281） 4.87±0.691）Res（80 μmol/L） 4 41.37±0.961） 23.46±1.98 35.17±2.361） 6.89±0.381）

3 讨 论

肝癌的发生发展是一个复杂的、多因素参与的过程，肝癌患者的临床疗效与肿瘤的分期及分化程度、异型性密切相关，低分化的肝肿瘤细胞异质性较强，直接影响患者对化疗和其他治疗的应答［8-9］。此外超过2/3 的患者在确诊时已不能经手术切除，因此化疗不仅可以用来缓解不能经手术切除患者的临床症状，而且可以降低术后患者复发和转移的风险，进一步探明有效的化疗或者抗癌药物能够有效预防和控制癌症的发生与发展［10］。

研究发现，Res 对乳腺癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌、白血病、卵巢癌、皮肤癌等多种恶性肿瘤细胞均有明显的抑制作用［11-12］。Res 还具有抗病毒、抗衰老、抗变态反应、保肝等作用，是一种天然的抗肿瘤化学预防剂，在肿瘤发生的起始、增进和扩展3 个阶段，都具有较好的防癌活性，它可以抑制癌细胞增殖，促进癌细胞分化，诱导癌细胞凋亡［13］。还有研究表明Res 可提高机体巨噬细胞的吞噬率，增强机体的免疫应答［14-15］。Res 同时还能抑制蛋白酪氨酸激酶这一催化酪氨酸磷酸化的物质，该激酶包含在有丝分裂调节的细胞内的细胞质信息传导中，利用Res 抑制蛋白酪氨酸激酶，可能是通过阻止激酶功能而起到抗突变作用的［16-17］。

关于Res 对低分化肝癌细胞Hep3B 增殖凋亡的影响目前鲜有报道，本研究通过实验验证发现Res 可抑制低分化肝癌细胞Hep3B 细胞的增殖，且对低分化肝癌细胞Hep3B 细胞周期具有阻滞效应，并呈浓度依赖性；同时它还可以促进低分化肝癌细胞Hep3B 细胞的凋亡，这为肝癌的临床治疗提供了新思路与新方向。然而本研究只探讨了Res 对低分化肝癌细胞Hep3B 增殖凋亡的影响，仍存在诸多不足，包括未涉及Res 干预低分化肝癌细胞Hep3B 增殖凋亡的具体作用通路及机制，未在多种肝癌细胞中进行验证，在后续实验中将进行深入探讨。