miR-663b对低糖诱导的人椎间盘退变髓核细胞的细胞活性及凋亡的影响

王 鹏， 左 斌， 唐家国， 何精选

(长江航运总医院骨科， 湖北 武汉 430014)

下腰痛是椎间盘退变(intervertebral disc degeneration，IVDD)的主要症状，每年在全球影响数以百万人的正常生活，这导致了重大的经济和社会负担[1,2]。因此阐明椎间盘退变的确切机制很重要，以便确定这种残疾的新疗法。miRNA在人类多种疾病中的重要调控作用得到很多研究的认可，其中包括椎间盘退变[3]。但是仍有部分新发现的miRNA在疾病中的功能仍待开发，如miR-663b在椎间盘退变中的功能尚未十分清楚。本研究旨在探索miR-663b对椎间盘退变髓核细胞增殖、凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1材料:组织样本来自本医院2019年2月至2019年12月期间确诊收治的人椎间盘退变患者22例及外伤致脊柱爆裂性骨折患者22例，所有患者和家属均签署知情同意书，并获得本医院医学伦理委员会的批准。纳入标准：年龄在60岁以下、临床表现腰痛及一侧下肢疼痛麻木、Lasegue阳性、DR和CT检查显示L4/5或L5/S1椎间盘突出；排除标准：腰椎滑脱、肿瘤、感染者，外伤引起的椎间盘突出者，患者心、肺、肝、肾功能障碍者。细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子1A(cyclin-dependent kinase inhibitor 1A，P21)蛋白抗体CDKN1A购自上海雅吉生物科技有限公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Cysteine aspartic protease，Caspase-3)兔多克隆抗体(ab44976)购自博士德生物工程有限公司；辣根过氧化物酶标记的二抗购自武汉艾美捷科技有限公司；细胞计数试剂盒(cell counting kit，CCK-8)购自Dojindo公司；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(membrane-linked protein V-fluorescein isothiocyanate/ propidine iodide，Annexin V-FITC/PI)双染细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天生物研究所。所涉及的重组质粒、引物均送至上海吉玛公司完成。

1.2方 法

1.2.1细胞的分离培养:参考张世磊等[4]的方法分离、培养人椎间盘髓核细胞。将清洗过的椎间盘组织用无菌组织剪剪碎，将其用0.25%胰酶消化1h，离心，收集沉淀细胞。将收集的细胞用20%的DMEM完全培养基在37℃、5%CO2的培养箱中培养、传代。

1.2.2细胞分组:把正常培养的人椎间盘退变髓核细胞随机分为对照组、低糖组、低糖组+miR-NC组、低糖组+miR-663b组、低糖组+anti-miR-NC组、低糖组+anti-miR-663b组。各个组的处理方式为：对照组，葡萄糖浓度为5mmoL/L的培养液培养人椎间盘退变髓核细胞48h；低糖组：葡萄糖浓度为1mmoL/L的培养液培养细胞48h；低糖组+miR-NC组(转染miR-NC)、低糖组+miR-663b组(转染miR-663b mimics)、低糖组+anti-miR-NC组(转染anti-miR-NC)、低糖组+anti-miR-663b组(转染anti-miR-663b)为用3倍重组质粒量的脂质体与质粒混合均匀，在与低糖组细胞共培养5 h，继续添加新培养液培养48 h，用qRT-PCR法检测转染的效率，确认转染成功后方可用于后续实验。

1.2.3qRT-PCR实验:将充分研磨的组织或需要检测的细胞用总RNA抽提试剂盒提取总RNA，再用反转录试剂盒合成cDNA，用作qRT-PCR实验的模板。按照qRT-PCR试剂盒要求操作，结果以U6为模板，2-△△Ct法计算miR-663b的表达。反应条件为95℃，反应5min，95℃变性15s，60℃退火，延伸30s，共40个循环。引物为：miR-663b，5'-TATTTTATTAAGGGGGAAGTGT-3'，5'-CCTCRATAAAAAAACCTTCTCT-3'；U6，5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.2.4CCK-8实验:将需要检测的细胞用培养液调整至105个/mL，取其中100μL至于24孔板，再按照CCK-8试剂盒加入CCK-8反应液，结果在450nm波长下检测细胞的吸光值(OD值)。

1.2.5Western blot实验:收集需要检测的细胞，提取总蛋白并定量。将蛋白用于SDS-PAGE蛋白电泳，再将胶上的蛋白转移至PVDF膜。将带有蛋白的膜用5%的脱脂奶粉封闭2h，再浸入一抗溶液(1∶1500)中4℃孵育过夜，次日再浸入二抗溶液(1∶1000)中37℃孵育2 h。最后，用电化学发光试剂盒对膜进行显影曝光。

1.2.6流式细胞术实验:将需要检测的细胞洗涤3次后重悬，再用结合缓冲液悬浮细胞。按照Annexin V-FITC/PI双染试剂盒的要求操作，加入Annexin V-FITC、PI，避光反应10min后，上流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。细胞凋亡率为早期细胞凋亡率与晚期细胞凋亡率之和。

1.2.7统计学处理:实验中所有数据均使用SPSS22.0进行分析，多组间数据的比较采用单因素方差分析联合SNK-q检验，两组数据比较采用独立样本t检验。P<0.05为差异有统计意义。

2 结 果

2.1miR-663b在人正常椎间盘髓核组织和退变椎间盘髓核组织中的表达:运用qRT-PCR法检测组织中miR-663b的表达水平，与人正常椎间盘髓核组织相比，人退变椎间盘髓核组织中miR-663b的表达水平明显降低(P<0.05)，见表1。

表1 miR-663b在人正常椎间盘髓核组织和人退变椎间盘髓核组织中的表达

2.2过表达miR-663b对低糖诱导的人椎间盘退变髓核细胞的细胞活性的影响：通过CCK-8法检测细胞的OD值，Western blot检测细胞中P21的蛋白表达。结果如图1和表2所示，与对照组相比，低糖组人椎间盘退变髓核细胞中miR-663b表达显著降低，细胞的OD值显著降低，P21蛋白表达量显著升高(P<0.05)；与低糖组+miR-NC组相比，低糖组+miR-663b组细胞中miR-663b表达上升，细胞的OD值明显下降，P21蛋白表达量明显升高(P<0.05)。

图1 P21蛋白的表达

表2 过表达miR-663b对低糖诱导的人椎间盘退变髓核细胞的细胞活性的影响

表3 过表达miR-663b对低糖诱导的人椎间盘退变髓核细胞凋亡的影响

2.3过表达miR-663b对低糖诱导的人椎间盘退变髓核细胞凋亡的影响：流式细胞术检测细胞的凋亡，Western blot检测细胞中Caspase-3的蛋白表达。结果如图2和表3所示，与对照组相比，低糖组细胞凋亡率显著升高，Caspase-3蛋白表达量明显升高(P<0.05)；与低糖组+miR-NC组相比，低糖组+miR-663b组细胞凋亡率发生下调，Caspase-3蛋白表达量也发生下调(P<0.05)。

2.4抑制miR-663b对低糖诱导的人椎间盘退变髓核细胞的细胞活性的影响：结果如图3和表4所示，与对照组相比，低糖组细胞中miR-663b明显降低，细胞的OD值也发生下降，P21蛋白表达量明显上升(P<0.05)；与低糖组+anti-miR-NC组相比，低糖组+anti-miR-663b组细胞miR-663b表达、细胞的OD值和P21蛋白表达量则发生相反的调控作用(P<0.05)。

表4 抑制miR-663b对低糖诱导的人椎间盘退变髓核细胞的细胞活性的影响

图2 过表达miR-663b对低糖诱导的人椎间盘退变髓核细胞凋亡及Caspase-3蛋白表达的影响

图3 P21蛋白的表达

2.5抑制miR-663b对低糖诱导的人椎间盘退变髓核细胞凋亡的影响：结果如图4和表5所示，与对照组相比，低糖组细胞中细胞凋亡率明显升高，Caspase-3蛋白表达量发生升高(P<0.05)；与低糖组+anti-miR-NC组相比，低糖组+anti-miR-663b组细胞的凋亡率和Caspase-3蛋白表达量发生相反的调控作用(P<0.05)。

图4 抑制miR-663b对低糖诱导的人椎间盘退变髓核细胞凋亡及Caspase-3蛋白表达的影响

表5 抑制miR-663b对低糖诱导的人椎间盘退变髓核细胞凋亡的影响

3 讨 论

本研究发现，miR-663b在人退变椎间盘髓核组织和低糖诱导的人椎间盘退变髓核细胞中的表达均发生明显的下调。胡凯等[5]在研究中发现，miR-663b在退变椎间盘髓核组织中的表达发生明显的下调，这与此实验得到的结果相一致，但是，miR-663b在人椎间盘退缩中的功能尚未清楚。近期有很多研究报道，miRNA在椎间盘退缩中的调控功能，如miR-125b-1-3p、miR-200c等[6]。miRNA在人类机体的很疾病的发生发展中均具有重要的调控作用，由于miRNA发生作用的调控网络异常复杂，因此其发挥作用的调控机制仍需探索。椎间盘退变的进展涉及多种复杂因素，例如炎症、氧化应激、机械损伤和细胞衰老等[7]。

本研究发现，过表达miR-663b能够促进低糖诱导的人椎间盘退变髓核细胞的增殖，抑制凋亡，并上调其中P21、Caspase-3的蛋白表达，抑制miR-663b则具有相反的作用。胡凯等[5]在研究中提示，MMP2能够促进退变椎间盘细胞外基质的降解，促进椎间盘退变的发生，并且MMP2为miR-663b的直接靶标，也就是说，在椎间盘退变中由于miR-663b的下调，上调了MMP2的表达，间接促进了椎间盘的退缩。这暗示，miR-663b的模拟物对椎间盘退变的治疗具有潜在的应用价值。这与此研究的观点相吻合，均支持miR-663b在椎间盘退变过程中发挥积极的作用。不足之处为该实验的结果尚未在动物体内得到更充分的验证。P21在许多转化细胞中受到p53通路的调控，细胞周期蛋白和CDKs在二元复合物中相互结合，形成细胞周期调控机制的核心。P21具有抑制细胞周期蛋白/CDK激酶的能力，并且过表达P21可能导致细胞周期的阻滞[8]。Caspase家族是细胞凋亡的核心。Caspase合成后以酶原的形式存在于细胞质中，在Caspase接收到相关的信号指令后发生连锁反应，使Caspase被裂解和激活，进而导致信号级联放大，激活多种下游蛋白酶，从而启动多种凋亡通路。caspase的裂解是一个可逆的过程，caspase-3的激活是一个不可逆的过程，caspase-3是凋亡信号的最终执行者[9]。

综上所述，miR-663b在椎间盘退变中异常下调，其可促进椎间盘退变髓核细胞的增殖，抑制凋亡，对椎间盘退缩的治疗具有理论参考价值。