血小板膜标志物表达水平与颈动脉粥样硬化病人支架内再狭窄的关系

王涛 张梅 余传庆 薛敏 武庆彬 康殿贵

颈动脉粥样硬化(carotid atherosclerosis，CAS)是指颈动脉因长期受血流冲击导致血管内膜机械性损伤，进而引起内膜下脂质沉积，血小板黏附聚集，造成血管腔狭窄[1]。随着血管内介入技术的不断发展，颈动脉支架成形术已成为CAS性狭窄的重要治疗手段之一，由于安全、有效、微创的优点，已得到广泛应用[2]，然而研究报道术后3年支架内再狭窄(ISR)发生率为3.4%，病人术后脑卒中及死亡的发生率明显增加[3]。因此分析颈动脉支架成形术后ISR的危险因素，可为制定治疗决策带来重要参考。有研究发现血小板活化与ISR密切相关，是ISR的独立危险因素[4]，而α颗粒膜糖蛋白(CD62p)及溶酶体膜蛋白(CD63)是血小板活化的重要膜敏感性标志物[5]，为此，本研究分析了影响CAS狭窄病人支架成形术后ISR的相关危险因素，探讨了血小板膜标志物CD62p及CD63的表达水平与ISR的关系，旨在为预防CAS病人支架成形术后ISR提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2015年10月至2017年6月于我院确诊为CAS且行颈动脉支架成形术的病人共124例病人，最终将临床资料完整且完成随访106例纳入分析，其中男76例，女30例，年龄60～78岁，平均年龄(69.28±3.17)岁，106例病人共放置支架119枚，其中13例因首次支架放置不佳而进行2次支架置入。病人按是否发生ISR分为ISR组和非ISR组(NISR组)所有病人均知情同意本研究并自愿签署知情同意书，本研究经我院伦理委员会审核通过。

1.2 纳入与排除标准 纳入标准：2组病人均经超声及数字减影血管造影(DSA)诊断为CAS[6]；符合颈动脉支架成形术的手术指征，即有临床症状的病人狭窄程度≥50%或无临床症状的病人狭窄程度≥70%；所有病人均自愿接受抽血、彩超及DSA检查；认知功能正常，可配合研究过程。排除标准：对碘造影剂过敏者；合并心、肝、肾等重要脏器损伤者；非CAS引起的血管病者；合并恶性肿瘤者；合并血液系统疾病者；合并精神障碍者。

1.3 颈动脉支架成形术治疗过程 术前2 h开始经静脉泵持续泵注尼莫地平注射液，手术选择经股动脉入路，在局麻条件下进行，穿刺股动脉并放置股动脉鞘，颈动脉给予70 IU/kg剂量的肝素，而后每小时追加1/2的初始剂量，先行全脑血管造影确定狭窄部位及程度，使用导引管将导丝送至狭窄处，经导丝放置颈动脉支架。在术后开始给予阿司匹林及氯吡格雷，而后减量，维持终身服用。手术均由经验丰富的介入医师操作完成。治疗期间根据病人实际情况给予降压、降糖、调脂、戒烟、戒酒等对症处理。

1.4 观察指标 收集2组病人性别、年龄、吸烟史、酗酒史、卒中史、高血压、DM、CHD、高血脂、使用支架数量、术后抗血小板药物应用依从性等一般资料；采用DSA检查确认2组病人术前狭窄程度及术后有无残余狭窄。

血小板膜标志物CD62p、CD63的测定：分别于术前及术后1个月抽取所有病人全血10μL，分为2份，各5μL，分别将其加入20μL CD62p单克隆抗体、20μL CD63单克隆抗体(均由美国R&D Systems公司提供)中，在室温环境下避光反应20 min后将其加入4 mL磷酸缓冲盐溶液(PBS)中，混合均匀后再加入1 mL 1%多聚甲醛(2～8 ℃)，低温环境下避光固定30 min，而后上机检测。选择488 nm波长的氩离子激光门，通过侧向及前向散射光设定血小板门，区分血小板群和其他细胞及颗粒，共检测5000个血小板，测定出荧光标记阳性的血小板数量，并计算百分率，荧光标记阳性的血小板百分率即为CD62p、CD63的表达率。

1.5 术后随访 所有病人均于术后1个月、3个月、6个月及之后每半年复查颈部血管彩色多普勒超声及DSA检查判定是否存在ISR，随访时间截至2018年6月，以ISR或病人死亡为随访终点。ISR判定标准为：经DSA检查证实支架部位血管管腔狭窄程度≥50%，排除支架断裂及支架内血栓(ISR的范围包括支架近、远两端5 mm以内)。

2 结果

2.1 随访结果 106例颈动脉支架成形术均成功。在围手术期，4例并发短暂性脑缺血发作，2例并发非致残性脑卒中，未出现围手术期死亡病例。复查DSA的结果显示，在ISR病人中，中度再狭窄(狭窄程度为50%～69%)ISR 9例，重度再狭窄(狭窄程度≥70%)7例；5例重度再狭窄病人并发脑卒中，另外11例无明显临床症状；5例重度再狭窄病人实施了球囊扩张血管成形术；2例重度再狭窄病人分别于术后6个月、8个月因大面积脑梗死而死亡。

2.2 影响颈动脉支架成形术后ISR的单因素分析 2组在吸烟史、高血压、DM、支架数量、术后残余狭窄、术后抗凝药物应用依从性、术后1个月CD62p及CD63的表达率方面差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 影响颈动脉支架成形术后ISR的单因素分析(n)

2.3 影响颈动脉支架成形术后ISR的多因素Logistic回归分析 将单因素分析差异有统计学意义的项目进行Logistic逐步回归分析，结果显示，支架数量、术后残余狭窄、术后1个月CD62p及CD63的表达率是颈动脉支架成形术后ISR的独立危险因素，见表2。

表2 影响颈动脉支架成形术后ISR的多因素分析

2.4 术后1个月CD62p及CD63表达率预测ISR的ROC分析 以是否发生ISR为结局，分别以术后1个月CD62p及CD63的表达率绘制ROC曲线。结果显示，术后1个月CD62p的表达率>5.43%是预测ISR的最佳切点，灵敏度为88.42%，特异度为76.27%；术后1个月CD63的表达率>8.13%是预测ISR的最佳切点，灵敏度为77.34%，特异度为90.68%。见表3，图1。

表3 术后1个月CD62p及CD63表达率预测ISR的ROC分析

图1 术后1个月CD62p及CD63表达率预测ISR的ROC分析

3 讨论

据统计大约51.1%的短暂性脑缺血发作病人存在不同程度的CAS，其发病率随年龄增加而增高[7]。目前颈动脉支架成形术是临床上治疗CAS狭窄的重要方式之一。然而，老年人在术后易出现ISR等问题，严重影响了手术的远期疗效。近年研究发现血小板活化可促进血小板聚集及血栓形成而导致支架内再狭窄的发生发展[8]，而CD62p及CD63是血小板活化的重要标志物。本研究在分析CAS狭窄病人支架成形术后ISR相关危险因素基础上，同时评估血小板膜标志物CD62p及CD63作为ISR标志物的潜在价值。

Logistic回归分析结果显示支架数量、术后残余狭窄、术后1个月CD62p的表达率、术后1个月CD63的表达率是颈动脉支架成形术后ISR的独立危险因素。段春苗等[9]指出颈动脉支架成形术术中使用支架数量及术后残余狭窄是颈动脉ISR的危险因素，本研究进一步证实了该结论。当支架数量增多时，血管腔内阻力增大，极易对血管内皮细胞造成损伤，导致血小板黏附及聚集，促进血栓形成，进而导致支架内再狭窄[10]。支架植入血管后可导致附壁血栓的形成，造成ISR，尽管目前所使用支架均为自膨式支架，有一定的自膨趋势，但如术后残余狭窄较重，支架的膨胀无法充分抵消附壁血栓所致的再狭窄趋势[11]，可导致ISR。

CD62p也称P-选择素，在正常机体CD62p表达较少，当血小板活化时，CD62p可大量表达，促使血栓的发生与发展，是目前反映血小板活化的金标准[12]。CD63是溶酶体膜蛋白的一种，正常机体血小板表面CD63表达率极低，当血小板活化时，其可迅速在血小板表面表达，参与血栓的形成，反映血小板活化的敏感性及特异性较高[13]。杨铁骊等[14]指出术后1个月血小板活化标志物CD62p及CD63的表达率是冠状动脉介入治疗术后ISR的独立危险因素，与本研究结果相似。基于此，本研究将术后1个月CD62p及CD63的表达率绘制ROC，术后1个月CD62p的表达率>5.43%、CD63的表达率>8.13%是预测ISR的最佳切点，具有较高的预测价值，可用于CAS狭窄病人支架成形术后ISR的早期预测。CAS狭窄病人支架成形术后可导致血管内膜损伤，内皮下胶原暴露，血小板活化，促进血小板活化标志物CD62p及CD63的表达，激活血小板形成白色血栓，引起ISR;同时引发炎症反应，促使细胞因子、生长因子等大量释放，促进中层平滑肌增殖并向血管腔移行，进一步加重ISR[15]。

综上所述，术后1个月血小板膜标志物CD62p、CD63的表达水平与ISR密切相关，其和支架数量及术后残余狭窄均为术后ISR的独立危险因素，可作为预测行颈动脉支架成形术后ISR的指标。