儿童传染性单核细胞增多症临床特点和PBMC病毒载量在预后的评估价值

曾 文 麦荣嘉 邓文喻 黄 研 郭家铭

广东省妇幼保健院 广东广州 510010

Epstein-Barr病毒(EBV)，也被称为人类疱疹病毒4 (HHV-4)，是一种双链DNA病毒，据估计95%的全世界的人口血清呈阳性。EBV原发感染多数无明显症状或表现为上呼吸道感染，部分患儿在感染可发展为传染性单核细胞增多症(IM)[1-2]。IM是一种良性的淋巴细胞增殖性疾病，多数表现为急性发作，并具有自限性；然而，少部分患儿会在病毒持续的感染下，出现严重威胁生命的并发症，此类患者即为慢性活动性EB病毒感染(chronic active EBV disease，CAEBV)，或者甚至由IM演变为EB病毒相关性噬血细胞综合症(hemophagocytic syndrome，HPS)又称噬血细胞性淋巴组织细胞增生症(hemophagocytic lymphonistiocytosis，HLH)[3，4]。近年来研究发现，EBV-DNA载量检测对原发性IM的早期诊断有重要意义[5]，但是为了进一步深入研究初诊EBV-DNA拷贝数水平，外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)的拷贝数变化与患者疾病进展预后情况之间的关系，本研究总结了本院收治的 68例EBV感染患者的临床资料并对其预后情况进行分析。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2019年1月—2021年1月于广东省妇幼保健院诊断为原发性EBV感染(IM)共68例住院患儿的临床资料。

IM诊断标准是参考《儿童主要非肿瘤性EB病毒感染相关疾病的诊断和治疗原则建议》[6]：①临床表现：发热、咽峡炎、淋巴结肿大、肝脾肿大；②外周血白细胞分类以淋巴细胞为主，异形淋巴细胞百分比>10%；③EBV感染依据：EB病毒衣壳抗原抗体(EBV-VCA-IgM)阳性。具备诊断标准①中任意3项，并同时具备③，有或无②，可诊断IM。HLH诊断标准采用 HLH-2004 诊断标准[7]。

1.2 方法

EBV核酸提取及检测(荧光定量PCR法)，实时荧光定量PCR检测EBV-DNA 采用核酸提取试剂盒提取外周血DNA，EBV检测试剂盒进行荧光定量 PCR 反应,严格按照说明书进行操作。以拷贝数>500 拷贝数/mL为阳性。根据EBV-DNA载量将68例EBV感染患儿分为低拷贝组(<104拷贝/mL)42例，高拷贝组(>104拷贝数/mL)26例，比较不同EBV-DNA载量IM患儿TBNK淋巴细胞亚群、生化指标水平、预后状态以及预后EBV-DNA载量。

PBMC的分离提取采集患者全血约 5 mL，以5 mL PBS稀释。缓慢将5 mL稀释的血液溶液加入到2.5 mL Ficoll溶液中，离心 20 min，然后收集含单核细胞层细胞。并采用核酸提取试剂盒提取PBMC的DNA。

1.3 流式细胞仪分析TBNK淋巴细胞亚群

取20 μL抗凝血,加入红细胞裂解液溶解红细胞,离心 (1 000 r/min,5 min)，弃上清，加入荧光标记抗体CD3+T 细胞、CD4+T 细胞(CD3+CD4+)、CD8+T细胞(CD3+CD8+)、NK细胞(CD3-CD16+和56+)、B淋巴细胞(CD19+)，震荡混匀，室温避光孵育15～20 min，取200 μL置于流式细胞仪检测。

1.4 肝功能检测

生化指标丙氨酸氨基转移酶(ALT)、谷氨酸氨基转移酶(AST)检测于ADVIA2400生化仪上进行检测。患儿ALT持续升高(>40 U/L)或AST持续升高(>40 U/L)，则判断为肝功能异常[8]。

1.5 对68例患者在出院后1～2个月内进行随访

患者在我院门诊或病房随访，并且进行回访EBV-DNA载量检测(拷贝数>500 拷贝数/mL为阳性)。有完整随访患者62例，3例患者失访，失访率为 4.84%。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 组间年龄、性别比较

低拷贝组42例，男25例，女17例，年龄1～11岁，平均(3.12±2.2)岁；高拷贝组26例，男15例，女11例，年龄1～12岁，平均(3.89±2.5)岁。两组间性别及年龄比较无统计学差异(P>0.05)。

2.2 临床症状与体征特点

68例EBV感染患儿均有发热症状，其中低拷贝组的眼睑水肿、淋巴结肿大、肝脾肿大发生率显著低于高拷贝组，差异有统计学意义(均P<0.05)。而扁桃体肿大、皮疹以及噬血细胞综合征在两组间差异均无统计学意义(P>0.05)。见图1。

图1 两组间患儿临床特点

2.3 两组患儿淋巴细胞亚群以及肝功能指标水平比较

表1结果显示，高拷贝组患儿的CD8+T细胞为(48.21±10.73)%高于低拷贝组的CD8+T细胞(38.1±10.04)，而 NK 细胞、CD4+T、CD4+/CD8+T细胞分别为(8.52±5.79)%、(21.37±5.78)%、(0.5±0.27)则均低于低拷贝组，差异有统计学意义 (P<0.05)。而两组间的CD3+细胞和B细胞比较，差异无统计学意义(P> 0.05)。高拷贝组的ALT和AST指标水平均高于低载量组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 两组间实验指标的比较

2.4 回访阳性病例的PBMC和血浆EBV DNA的检测结果

表1结果显示，在回访EBV-DNA检测中，高拷贝组15例(57.69%)高于阴性参考值，比低拷贝组的8例(21.62%)差异有统计学意义 (P<0.05)。在回访EBV-DNA阳性病例的23例样本中，PBMC EBV DNA拷贝数(4.8±0.5)高于全血EBV DNA拷贝数(2.96±0.28)，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

2.5 预后

低拷贝组里，42例患儿治疗时间为5～62 d, 平均治疗时间为 (10±8.93)d并且全部治愈。而高拷贝组里，26例患儿治疗时间为7～92 d, 平均治疗时间为 (20.35±18.67)d。治疗天数的差异有统计学意义(P<0.05)。高拷贝组里有3例患儿发展为EBV-HLH(2例EBV-HLH治愈，1例转院后治愈)，1例发展为CAEBV(转院治疗中)以及1例为淋巴相关性肿瘤(转院失联)。

图2 回访阳性23患者PBMC与血浆EBV DNA拷贝数的比较***：P<0.05

3 讨论

EBV感染可累及全身各组织脏器，且根据个体的免疫功能差异或缺陷，可表现出IM、CAEBV、EB-HLH等多种疾病症状。目前，分子诊断技术EBV-DNA检测被广泛应用于EBV感染的临床诊断，其灵敏度和时效性优于血清学检测，对早期诊断儿童EBV感染具有重要意义[9]。IM被认为是EB病毒感染儿童时引发的一种免疫病理性疾病(immunopathological disease)，以发热、咽峡炎和颈部淋巴结肿大为主要临床特征。在该病病程发展中，EB病毒主要侵犯机体的B淋巴细胞，并刺激辅助 T 细胞(Th)、效应T细胞(CD4+)、细胞毒T细胞及抑制T细胞(CD8+)的大量增殖；CD4+细胞可分泌IL-6、IL-10、TNF-β等多种细胞因子，促进B细胞和效应 T 细胞的活化，参与细胞免疫和体液免疫的调节。而CD8+细胞通过杀伤感染的B淋巴细胞和分泌抑制因子，负向调节细胞的免疫功能[10-11]。

多数情况下，IM病情发展是具有自限性。随着病程变化，IM外周血中EBV-DNA载量能反映病毒感染的活动状况。国外报道，原发IM可检测到病毒核酸的时间段在12～22天之间，往后EBV-DNA 拷贝数趋向于阈值。本研究发现，高拷贝组患儿的免疫功能紊乱以及肝功能异常比低拷贝组严重，同时病程也大大延长；而高拷贝组患儿的淋巴细胞亚群分型中，可观测到明显的CD8+T 细胞数值升高和CD4+T 细胞数值减少，与以往国内报道[12-13]一致。

EBV感染在极少数患儿可发展为EB-HLH。HLH有原发性与继发性之分。继发性HLH主要因感染(包括病毒、细菌、结核以及真菌等)而诱发机体产生自身免疫系统过度炎症反应的综合征，这与原发性HLH的病因有明显的区别。国内研究报道继发性HLH中，以EB病毒诱发的HLH最为常见[14-15]。本研究中有3例患儿为EBV-HLH，均符合其诊断标准[6]，并且初诊EBV-DNA载量均大于105拷贝数/mL。本研究显示，高拷贝组EBV感染后EBV-HLH的发生率为11.54%。3例患儿均有反复高热，肝脾肿大等体征；血常规报告中均有三系血象减少，血清铁蛋白异常升高以及凝血指标异常；骨髓细胞学检查结果均出现吞噬血细胞现象, 骨髓象呈增生活跃。以上数据提示，初诊结果中高载量的EBV-DNA可预示患儿病情凶险，有出现严重并发症的可能，如噬血细胞综合征(HLH)。

另外，EBV在感染细胞内主要有2种存在形式：增殖性感染和潜伏性感染。而EBV DNA是EBV感染/潜伏的直接证据。目前学界认为，PBMC的EBV-DNA载量检测在应用于追踪 EB病毒感染患儿预后状况中具有重要意义。EBV 长期潜伏于人体的淋巴系统里，以小的非增殖的记忆B细胞形式持续存在，呈现一种相对静止的状态；EBV-DNA作为EBV潜伏感染的基础，通过部分表达病毒蛋白，于体内形成免疫复合物，促使补体激活免疫细胞引发机体免疫效应，进而导致自身免疫系统受损，严重者将发展为CAEBV、EB-HLH、EB相关的伯基特淋巴瘤和鼻咽癌等肿瘤。研究发现，PBMC的EBV-DNA阳性率和拷贝数均高于血浆的检测结果，且该结果与治疗效果密切相关[16]。因此对于高拷贝的EBV感染的病例，可考虑运用PBMC的EBV-DNA 定量检测，动态观察血中 EBV-DNA 载量，有利于监测病情变化，观察治疗效果，指导临床治疗。