调节性T细胞联合维生素D3对小鼠复发性流产的治疗研究

段 彪 王 璐 冯 清 周志伟 杜海燕

1赣州市人民医院 江西赣州 341000;2内蒙古医科大学第三附属医院 内蒙古包头 014010

复发性流产(recurrent miscarriage, RM)是常见的妊娠并发症，定义为妊娠20周前两次或两次以上自然流产[1]。与RM相关的危险因素主要包括感染、遗传和自身免疫因素等[2]。CD4+T细胞亚群在母胎界面免疫调节中发挥重要作用，包括T辅助细胞1(T helper, Th1)、Th2、调节性T细胞(regulatory T, Treg)和Th17细胞等。其中Treg细胞具有高度的免疫抑制作用，叉头盒P3(Forkhead box P3，Foxp3)是其分化重要的核转录因子。Th17细胞被认为会影响慢性炎症并控制真菌感染，越来越多的证据表明Treg和Th17细胞在妊娠建立和维持中具有重要作用[3]。在一项关于流产小鼠模型的研究表明应用妊娠期的Treg细胞进行免疫治疗可以逆转由IL-17诱导的流产[4]。调节Treg/Th17平衡可能是RM患者的一种新颖且有希望的治疗策略。目前，维生素D3对Treg/Th17平衡的调节成为生殖免疫方面的研究热点。维生素D首先在肝脏中被25-羟化酶(CYP2R1)代谢为25(OH)D3，接着在肾脏中被1-α-羟化酶(CYP27B1)代谢为完全活化维生素D形式1,25(OH)2D3[5]。包括免疫细胞在内的很多细胞均表达维生素D受体(VDR)和CYP27B1[6]。1,25(OH)2D3是一种有效的免疫调节剂，通过特异性结合VDR，能够抑制Th17细胞的增殖和细胞因子的产生，如IFN-γ、IL-2和TNF-α。同时，能够诱导Foxp3的表达和Treg细胞的分化，达到对妊娠的保护作用[7-8]。本研究通过动物实验，探讨联合使用Treg细胞和维生素D3治疗RM，从而为治疗RM提供新的治疗思路和方法。

1 材料和方法

1.1 实验动物及试剂

实验动物：雌性CBA/J小鼠(7～8周龄、18～21 g)、雄性DBA/2J(9～10周龄、22～25 g)和雄性BALB/c小鼠(9～10周龄、22～25 g)购自南京大学模式动物研究所。所有实验小鼠均为SPF级，饲养条件为温度22±1 ℃、光周期调控(12 h/12 h的光照/黑暗)和相对湿度50%～60%。

试剂：维生素D3和RIPA裂解缓冲液购自Sigma公司；免疫磁珠分离试剂盒购自MiltenyiBiotec公司；Ficoll淋巴细胞分离液购自达优公司；RPMI1640培养液购自为Gibco公司；所有抗体购自Biolegend公司；CFSE和TRIzol试剂购自Invitrogen公司；反转录试剂盒和SYBR Green购自TaKaRa公司；二辛可宁酸(BCA)蛋白测定试剂盒购自Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 孕鼠外周血来源Treg细胞的分离 将CBA/J雌鼠与BALB/c雄鼠进行交配，次日早晨检查阴道栓。见栓后分笼饲养，见栓日计为孕0.5 d。抽取孕14周CBA/J雌鼠的外周血10 mL，置于预先加有肝素的15 mL离心管中。血液样品用PBS以1 ∶1稀释。然后，以相同体积缓缓置于Ficoll液上方，室温下800 g离心30 min。通过密度梯度离心法分离外周血单核细胞(PBMCs)。CD4+CD25+Treg细胞和CD4+CD25-T细胞用免疫磁珠分离试剂盒的产品说明步骤进行分选和富集。

1.2.2 Treg细胞的鉴定及功能鉴定分型 吸取分离的Treg细胞悬液100 μL，进行CD4和CD25抗体的双单克隆抗体或同型对照染色，采用流式细胞仪检测抗体阳性细胞的比率。接着，使用混合淋巴细胞反应进行功能鉴定。用CFSE标记分离的CD4+CD25-T细胞，将其作为效应T细胞(Teff)。用抗CD3 /抗CD28免疫磁珠激活效应T细胞，并在96孔板中以1×105个效应细胞/孔的密度接种。将CFSE标记的Teff细胞和Treg按照1 ∶1的比例混合，在37 ℃、5 % CO2的条件下进行培养。72 h后，收集细胞并通过流式细胞仪检测，分析CD4+CD25-T细胞的增殖抑制情况。

1.2.3 RM流产小鼠模型的建立 流产组为CBA/J雌鼠×DBA/2J雄鼠，对照组为CBA/J雌鼠×BALB/c雄鼠。所有组合小鼠按照雄:雌=1 ∶2的比例于拟交配日18:00合笼，次日早8:00检查阴道栓，见栓后分笼饲养，见栓日计为孕0.5 d。

1.2.4 联合使用Treg细胞和维生素D3的免疫治疗 将CBA/J雌鼠随机分为6组(联合治疗组、Treg细胞组、维生素D3组、生理盐水组、空白对照组及正常妊娠组)，每组数量为10只，前5组雌鼠与DBA/2J雄鼠交配，第6组雌鼠与BALB/c雄鼠交配作为正常妊娠组。联合治疗组交配前2天给予尾静脉注射孕鼠外周血分离得到的Treg细胞(细胞浓度2×106/mL，注射量100 μL)，自妊娠第2天开始每日腹腔注射生理盐水稀释的维生素D3溶液0.2 mL，单次给药剂量为4 μg。Treg细胞组在交配前2天给予尾静脉注射孕鼠外周血分离得到的Treg细胞，自妊娠第2天开始每日腹腔注射生理盐水0.2 mL。维生素D3组在交配前2天给予尾静脉注射50 μL生理盐水，自妊娠第2天开始每日腹腔注射生理盐水稀释的维生素D3溶液0.2 mL，单次给药剂量为4 μg。生理盐水组在交配前2天给予尾静脉注射50 μL生理盐水，自妊娠第2天开始每日腹腔注射生理盐水0.2 mL。空白对照组不做任何处理。

1.2.5 流式细胞术检测外周血Treg和Th17细胞比率 在妊娠第13天颈椎脱臼法处死各组孕鼠，抽取外周静脉血10 mL,分离并收集各组孕鼠PBMCs。加入10 μg/mL FITC标记的抗小鼠CD4和5 μg/mL PE标记的抗小鼠CD25，冰上避光孵育30 min后检测Treg细胞。加入10 μg/mL FITC标记的抗小鼠CD4和5 μg/mL PE标记的抗鼠IL-17A，冰上避光孵育30 min后检测Th17 细胞。

1.2.6 胚胎发育情况的观察 处死各组孕鼠后，分离子宫观察胚胎丢失情况。统计各组被吸收胚胎数和总胚胎数，根据公式计算胚胎吸收率(被吸收胚胎数/总胚胎数×100%)。

1.2.7 Q-PCR检测 使用TRIzol试剂按照产品说明提取胎盘组织样本的总RNA。使用反转录试剂盒合成单链cDNA，设计引物并进行Q-PCR扩增分析，引物序列如下表1所示。qRT-PCR条件为在95 ℃下2 min，在95 ℃下15 s、60 ℃ 15 s和72 ℃ 35 s的40个循环。应用Applied Biosystems 7500荧光定量PCR仪进行Q-PCR实验，记录每次测定的Ct值，以GAPDH为内参基因，得出的数据用2-△△Ct进行分析。每个样本重复三次。

表1 各种基因的引物序列

1.2.8 Western Blot检测 使用RIPA裂解液从胎盘组织中提取总蛋白，并用BCA试剂盒对总蛋白进行定量。将裂解物在4 ℃下15 000×rpm离心15 min。然后将蛋白质提取物进行SDS-PAGE电泳，并转移到聚偏二氟乙烯膜上。室温下用5%牛血清白蛋白封闭膜1 h后，用一抗(1 ∶2 000)和GAPDH(1 ∶5 000)4 ℃过夜检测目标蛋白。随后，室温下加入辣根过氧化物酶结合的山羊抗兔IgG(1 ∶20,000)，分别检测Foxp3、VDR、CYP27B1和CYP2R1的表达，以GAPDH作为内参。

2 结果

2.1 Treg细胞的鉴定及功能鉴定分型

分离后的细胞终产物中CD4+CD25+双阳性细胞的纯度为(93.34±1.18)%，图1显示分选后的Treg细胞用流式细胞仪检测的其表型特征。采用CFSE标记法检测CD4+CD25-Teff的增殖情况，观察加入Treg细胞后，Teff增殖是否受抑制。CD4+ CD25-Teff单独培养时的增殖率是31.2%；当加入CD3/CD28免疫磁珠后，细胞增殖率增至63.1%；当CD4+CD25-Teff与Treg在CD3 / CD28免疫磁珠存在的条件下以1 ∶1的比例共培养时，Teff的增殖率降至35.5%。结果显示CD4+CD25+Treg细胞对CD4+CD25-Teff细胞的增殖有明显抑制作用，见图2所示。

A.同型对照染色，B.分离的CD4+ CD25+Treg细胞的百分率

图2 分选CD4+CD25+Treg细胞对自体 CD4+CD25-Te增殖抑制的流式细胞图。M1代表增殖的自身CD4+CD25-Teff的百分率。A. CD4+CD25-Teff单独培养，B. 存在CD3/CD28磁珠的情况下培养的CD4+CD25-Teff，C. CD4+CD25-Teff与Treg在CD3/CD28磁珠存在的条件下以1 ∶1的比例共培养

2.2 Treg、Th17细胞比率及两者比值的比较

联合治疗组与其他5组相比在Treg、Th17细胞及两者的比值均具有显著差异，与单独Treg细胞或维生素D3组相比三项参数也有显著差异(P<0.05)，详见表2。

表2 Treg 细胞、Th17 细胞比率及两者比值比较

2.3 Treg细胞联合维生素D3治疗对相关基因表达的影响

与生理盐水组、空白对照组相比，联合治疗组、Treg细胞组、维生素D3组的Foxp3 mRNA表达均显著升高，其中联合治疗组的表达差异最大(P<0.001)，联合治疗组和维生素D3组之间的Foxp3 mRNA表达有显著差异(P<0.05)，见图3A，Foxp3蛋白表达显示同样的趋势，见图3E。在VDR mRNA的表达方面，与生理盐水组、空白对照组相比，联合治疗组、Treg细胞组、维生素D3组的表达均显著升高(P<0.01)，联合治疗组、Treg细胞组之间的表达有显著差异(P<0.05)，见图3B，VDR蛋白表达显示同样的趋势，见图3E。在CYP27B1 mRNA的表达方面，与生理盐水组、空白对照组相比，联合治疗组、Treg细胞组、维生素D3组的表达均显著升高(P<0.01)。与Treg细胞组相比，联合治疗组和维生素D3组的表达量显著升高(P<0.05)，见图3C， CYP27B1蛋白表达显示同样的趋势，见图3E。几组间CYP2R1 mRNA和蛋白表达无显著差异(P>0.05，图3D和3E)。

2.4 胚胎吸收率的比较

联合治疗组的胚胎吸收率与维生素D3组、生理盐水组、空白对照组相比，差异均有统计学意义(P<0.05)。联合治疗组与Treg细胞组、正常妊娠组相比，差异无统计学意义。Treg细胞组的胚胎吸收率与维生素D3组、生理盐水组相比，差异均有统计学意义(P<0.05)。Treg细胞组与联合治疗组、维生素D3组和正常妊娠组相比，差异无统计学意义，详见表3。

注：*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001

表3 胚胎吸收情况比较

3 讨论

胎儿作为同种异体抗原，在妊娠过程中不被母体免疫系统所排斥，这是母体和胎儿之间形成免疫耐受的结果。越来越多的证据表明，Treg和Th17细胞的失衡与RM发病有关，正常人妊娠与发挥免疫抑制作用的Treg亚群的升高有关[9-10]。同时，来自体外研究和动物模型的实验表明，维生素D3的活性形式可作为替代的免疫调节剂，维生素D3可以抑制或上调树突状细胞(DC)、Th1、Th2和Treg细胞中细胞因子的表达，可以抑制促炎性Th1和Th17细胞反应，同时通过增强白介素IL-4、IL-5和IL-10的产生来促进Th2和Treg细胞的表型[11-12]。

在本实验中联合治疗组与生理盐水注射组或空白对照相比，在Treg细胞、Th17细胞和两者的比值方面均具有显著差异，说明联合治疗的方式显著增加Treg细胞比率和Treg/Th17比值。Rafiee等研究了同时注射父方淋巴细胞和补充维生素D治疗人RM的效果，结果表明联合治疗降低了Th17/Treg比率和Th17细胞的比例，我们的结果与这一发现相符[13]。同时，联合治疗组与单独Treg细胞组或维生素D3组相比，三项参数也具有统计学差异，说明联合治疗的方式在改善Treg/Th17平衡方面优于单独治疗。Foxp3是Treg细胞内的标记分子和调节蛋白，其Q-PCR和Western Blot结果表明联合治疗组与单独维生素D3、生理盐水组和空白对照相比，表达量有统计学差异，而单独Treg细胞或维生素D3治疗与生理盐水组和空白对照相比也具有统计学差异，说明联合治疗的方式产生更多的Foxp3表达，单独Treg细胞或维生素D3治疗表达水平次之，结果表明维生素D3对于增加Foxp3+Treg的数量产生积极意义，这也与相关研究报道一致[14]。对于VDR的表达，联合治疗组、单独Treg或维生素D3与生理盐水组和空白对照相比均有统计学差异，说明这三种方式均导致胎盘组织部位表达更多的维生素D3受体。同时，联合治疗组与单独Treg组相比有统计学差异,与单独维生素D3组无差异，说明单独Treg不能增加VDR表达，只有增加体内维生素D3的水平才有利于提高其受体的表达水平。研究表明活化后的维生素D3可以与VDR结合并作用于VDR的启动子区域，增加其表达[15]。Kongsbak等[16]指出VDR的表达和活性很重要，它们在T细胞的发育和分化中以及在诱导效应子功能中发挥重要作用，VDR的活性和表达水平是控制维生素D3免疫调节的主要机制。对于CYP27B1的表达，联合治疗组、单独Treg或维生素D3与生理盐水组和空白对照相比，均有统计学差异，说明这三种方式均导致更多量的CYP27B1的表达。联合治疗组与单独Treg组相比有统计学差异,与单独维生素D3组无差异，说明单独Treg不能增加CYP27B1表达，增加体内维生素D3的水平才有利于提高代谢酶CYP27B1的表达。在胚胎吸收率上，联合治疗组与单独维生素D3、生理盐水组和空白对照相比有统计学差异，联合治疗的方式得到最低的胚胎吸收率。

综上所述，联合使用Treg细胞和维生素D3起到良好得调节RM中的Treg/Th17平衡的作用。在充足的维生素D3水平条件下，体内补充Treg细胞不但可以增加具有免疫抑制功能的Treg细胞的数量并维持其功能，还有利于体内Th17向Treg细胞的转化并减少炎症反应。我们的实验证实在联合使用的方法中Treg细胞、维生素D3和免疫调节相互联系和相互作用，为进一步深入研究RM的发病机理奠定了理论基础。因此，联合使用Treg细胞和维生素D3可成为免疫异常的RM患者的新治疗选择。