miRNA-451在宫颈癌中的表达及对宫颈癌Hela细胞增殖与凋亡影响的作用机制研究△

李艳，陈文玉，陈小平，陈友国

1盐城市第一人民医院/南京大学医学院附属盐城第一医院妇产科，江苏 盐城 224001

2苏州大学附属第一医院妇产科，江苏 苏州 215006

宫颈癌是临床最常见的女性恶性肿瘤之一，其发病率居女性所有恶性肿瘤的第二位，病死率居首位。流行病学调查结果显示，全球每年新增宫颈癌约60万例，新增病死30万例，严重威胁女性的生命健康。值得注意的是，中国每年新增宫颈癌患者超过全球新增宫颈癌病例的1/5，且呈年轻化趋势，发病率和病死率远高于发达国家，严重影响中国女性的生命健康。宫颈癌的发生发展与多种因素有关，但目前临床关于宫颈癌的发病机制仍未完全阐明。早期宫颈癌多无明显症状，极大地影响了宫颈癌患者的早期临床诊断和治疗，因此，积极探索宫颈癌早期诊断和治疗的生物标志物对临床宫颈癌的诊断和治疗有重要意义。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一种内源性小分子非编码RNA。近年来，越来越多的研究表明，miRNA能够调节多种基因的表达，对多种肿瘤增殖、凋亡、侵袭转移等恶性生物学行为有调控作用。miRNA-451是miRNA家族的重要成员之一，能够通过调节磷脂酰肌醇-3-羟激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋 白 激 酶 B（protein kinase B，PKB，又称AKT）等多种信号通路，抑制肝癌、胃癌、胰腺癌等多种恶性肿瘤发生发展，被认为是一种重要的抑癌因子。研究表明，miRNA-451在肝癌等肿瘤发生发展过程中异常表达，而miRNA-451过表达能够明显抑制肝癌细胞的增殖、侵袭和转移，被认为是肝癌预防和治疗的潜在生物靶点。但miRNA-451表达情况与宫颈癌发生发展关系的研究较少，因此，本研究探讨miRNA-451在宫颈癌组织中的表达及其与患者临床特征的相关性，并通过体外细胞实验探讨miRNA-451-mimics瞬时转染对宫颈癌Hela细胞增殖与凋亡的影响及可能机制，旨在为今后宫颈癌的临床诊断和治疗提供理论依据，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2017年1月至2018年12月盐城市第一人民医院收治的60例宫颈癌患者。纳入标准：均为初次确诊；均经病理学检查确诊为宫颈癌；术前未进行放疗、化疗等治疗。排除标准：术前进行化疗、放疗或激素治疗；肝肾功能不全或合并其他恶性肿瘤。60例宫颈癌患者年龄20～65岁；病理类型：鳞状细胞癌37例，腺癌23例；国际妇产科联盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO）分期：Ⅰ～Ⅱ期21例，Ⅲ～Ⅳ期39例；淋巴结转移26例，无淋巴结转移34例；分化程度：低分化19例，中高分化41例；基层浸润深度：≥1/2 35例，＜1/2 25例。本研究经医院伦理委员会批准通过，所有患者均知情同意并签署知情同意书。取60例宫颈癌患者的宫颈癌组织和相应癌旁正常组织，迅速置于液氮中冷冻，-80℃保存待检。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞、主要试剂和仪器 人宫颈癌Hela细胞株购自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所。总RNA提取试剂盒、定量逆转录聚合酶链反应（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）试剂盒、无酶水均购自天根生化科技（北京）有限公司，miRNA-451模拟物（miRNA-451-mimics）、miRNA-451-mimics阴性对照（miRNA-451-mimics-NC）均购自上海吉玛制药技术有限公司，miRNA-451上游引物、下游引物和探针均由上海星汉生物科技有限公司设计合成，胎牛血清、青霉素-链霉素、DMEM培养基均购自美国Gibco公司，CCK-8试剂购自日本同仁化学研究所，Lipofectamine3000转染试剂购自美国Thermo Scientific公司，细胞周期检测试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒均购自江苏凯基生物技术公司，磷酸化AKT（phosphoinositide AKT，p-AKT）、B细胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）、β-actin一抗和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）二抗均购自美国CST公司。实时荧光定量PCR仪、酶标仪均购自美国Bio-Rad公司，CO培养箱购自美国Thermo Scientific公司，流式细胞仪购自美国艾森公司，离心机购自上海舜制仪器公司，转印电泳仪购自北京六一公司，转膜仪购自美国Hoefer公司。

1.2.2 qRT-PCR检测宫颈癌组织和癌旁正常组织中miRNA-451的相对表达量 采用RNA提取试剂盒提取宫颈癌组织和癌旁正常组织中的总RNA，逆转录为互补DNA（complementary DNA，cDNA），采用qRT-PCR法检测miRNA-451的相对表达量。qRT-PCR反应体系为：cDNA 1µl，上下游引物 1 µl，PCR 荧光定量染料 5 µl，无酶水 4 µl。PCR扩增条件：95℃预变性2 min，95℃变性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸15 s，共40个循环。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）为内参，采用 2法计算miRNA-451的相对表达量。GAPDH上游引物：5'-TGTTCGTCATGGGTGTGAAC-3'，下游引物：5'-ATGGCATGGACTGTGGTCAT-3'；miRNA-451上游引物：5'-AAAGTCGACAAGCTCTCTGCTCAGCCTGTC-3'，下游引物：5'-AAAATATCTCGAGCCCCCACCCCTGCCTTGT-3'。

1.2.3 细胞培养与转染 宫颈癌Hela细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃、5% CO细胞培养箱中培养，取对数生长期的细胞用于后续实验。将Hela细胞随机分为对照组、miRNA-451-mimics组和miRNA-451-mimics-NC组，分别取20µg的miRNA-451-mimics和miRNA-451-mimics-NC加入至10 ml培养基中，并分别加入20µl的Lipofectamine3000转染试剂轻轻混合均匀，室温下孵育20 min后取适量加入至各组细胞中，对照组加入等量培养基，每组设3个复孔。

1.2.4 CCK-8法检测细胞的增殖能力 取对照组和 miRNA-451-mimics组细胞分别转染 6、12、24、36、48 h，qRT-PCR法检测miRNA-451的相对表达量。取对照组、miRNA-451-mimics组及miRNA-451-mimics-NC组细胞，以5000/孔接种至96孔板，每组设6个复孔，分别转染6、12、24、36、48 h后，每孔加入10µl的CCK-8试剂继续培养2 h。采用酶标仪于450 nm波长处测定各孔吸光度（A），计算细胞存活率。细胞存活率（%）＝（A-A）（/A-A）×100%。

1.2.5 流式细胞仪检测细胞周期情况 采用流式细胞仪检测miRNA-451-mimics瞬时转染对Hela细胞周期的影响。取转染24 h后的对照组、miRNA-451-mimics组及miRNA-451-mimics-NC组细胞，弃去上清液，用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）清洗3遍后收集细胞，用75%乙醇固定12 h，离心去除乙醇后加入PBS重悬细胞然后加入碘化丙啶（propidium iodide，PI）试剂500 µl，避光孵育15 min后，使用流式细胞仪检测细胞周期分布情况，上述实验重复3次。

1.2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡情况 运用流式细胞仪检测miRNA-451-mimics瞬时转染对宫颈癌Hela细胞凋亡的影响。取转染24 h后的对照组、miRNA-451-mimics组及miRNA-451-mimics-NC组细胞，弃去上清液，PBS清洗3次后收集细胞，加入500µl结合液重悬细胞后分别加入膜联蛋白V（Annexin V）-异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）/PI试剂各 5 µl，避光孵育15 min后使用流式细胞仪检测细胞凋亡率，实验重复3次。细胞凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.2.7 蛋白质印迹（Western blot）法检测p-AKT、Bcl-2蛋白的相对表达量 取转染24 h后对照组、miRNA-451-mimics组及miRNA-451-mimics-NC组宫颈癌Hela细胞，采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）测定各组细胞蛋白浓度制备蛋白样品。取30µg蛋白样品经过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）后，运用转膜仪将蛋白转至固相载体聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。运用5%脱脂牛奶封闭1 h后，分别加入p-AKT、Bcl-2、β-actin一抗（稀释浓度均为1∶1000）孵育过夜，然后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗（稀释浓度为1∶10 000）室温孵育1 h，电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）法检测并用Image J 2.0图像软件进行灰度值分析，实验重复3次。以β-actin作为内参，计算p-AKT、Bcl-2蛋白的相对表达量。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 宫颈癌组织和癌旁正常组织中miRNA-451相对表达量的比较

癌旁正常组织中miRNA-451的相对表达量为（6.808±2.402），明显高于宫颈癌组织中的（1.165±0.415），差异有统计学意义（t=17.78，P＜0.01）。

2.2 不同临床特征宫颈癌患者宫颈癌组织中miRNA-451表达情况的比较

以宫颈癌组织中miRNA-451相对表达量的中位数为界值，miRNA-451低表达30例，miRNA-451高表达30例。不同年龄、病理类型、肌层浸润深度宫颈癌患者宫颈癌组织中miRNA-451表达情况比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。不同FIGO分期、淋巴结转移情况、分化程度宫颈癌患者宫颈癌组织中miRNA-451表达情况比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表1）

表1 不同临床特征宫颈癌患者宫颈癌组织中miRNA-451相对表达量的比较（n=60）

2.3 不同转染时间宫颈癌Hela细胞中miRNA-451相对表达量和增殖能力的比较

随着转染时间的延长，miRNA-451-mimics组宫颈癌Hela细胞中miRNA-451的相对表达量均明显升高（P＜0.05），且转染24 h时，miRNA-451-mimics的转染效率最高，因此选择转染24 h作为后续实验转染条件。随着转染时间的延长，miRNA-451-mimics组宫颈癌Hela细胞的存活率逐渐降低。（表2、表3）

表2 不同转染时间宫颈癌Hela细胞中miRNA-451相对表达量的比较（±s）

表3 不同转染时间宫颈癌Hela细胞的存活率（%，±s）

2.4 miRNA-451过表达对宫颈癌Hela细胞周期的影响

转染24 h后，miRNA-451-mimics组细胞G/G期细胞百分比明显高于对照组和miRNA-451-mimics-NC组，G/M期细胞百分比明显低于对照组和miRNA-451-mimics-NC组，差异均有统计学意义（P＜0.01）；但3组S期细胞百分比比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（图1、表4）

表4 miRNA-451过表达对宫颈癌Hela细胞周期的影响（%，±s）

图1 miRNA-451过表达对宫颈癌Hela细胞周期的影响

2.5 miRNA-451过表达对宫颈癌Hela细胞凋亡的影响

转染24 h后，miRNA-451-mimics组细胞的凋亡率为（33.727±2.096）%，明显高于对照组的（0.883±0.246）%和 miRNA-451-mimics-NC组的（1.660±0.649）%，差异均有统计学意义（t=22.12、20.77，P＜0.1）。（图2）

图2 miRNA-451过表达对宫颈癌Hela细胞凋亡的影响

2.6 miRNA-451过表达对宫颈癌Hela细胞p-AKT、Bcl-2蛋白相对表达量的影响

miRNA-451-mimics组宫颈癌Hela细胞p-AKT、Bcl-2蛋白的相对表达量均明显低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表5）

表5 对照组与miRNA-451过表达组宫颈癌Hela细胞p-AKT、Bcl-2蛋白相对表达量的比较（±s）

3 讨论

宫颈癌是临床常见的女性恶性肿瘤，2018年全球宫颈癌调查研究报告显示，中国宫颈癌发病率明显高于欧美等发达国家，且呈年轻化趋势，严重威胁女性生命健康。此外，宫颈癌患者的预后较差，5年生存率低于50%，且其发生发展过程复杂，与细胞增殖、侵袭转移、基因异常表达、凋亡等多种过程密切相关。早期诊断、早期治疗，对降低宫颈癌患者的病死率、提高生存质量、改善预后均有重要意义。但由于宫颈癌早期缺乏特异性的症状，容易造成漏诊和误诊。因此，积极寻找宫颈癌发生发展过程中的生物标志物对临床宫颈癌的早期诊断和靶向治疗有重要意义。

miRNA是一类由内源基因编码的单链非编码RNA，对多种基因表达具有调控作用，在恶性肿瘤的发生发展中发挥着重要作用。越来越多的研究表明，miRNA调控基因的表达与宫颈癌的发生发展密切相关。值得注意的是，miRNA在血清和组织中的稳定性高，具有作为宫颈癌临床诊断标志物和治疗靶点的潜能。研究表明，miRNA-145、miRNA-34a、miRNA-206、miRNA-21等多种miRNA在宫颈癌发生发展过程中有重要作用。Anusha等研究表明，miRNA-145能够通过靶向SMAD 作用蛋白 1（SMAD-interacting protein 1，SIP1）调节宫颈癌细胞的上皮-间充质转化过程，抑制细胞的增殖、迁移和侵袭。miRNA-206是一种抑癌基因，能够明显抑制肝癌等多种恶性肿瘤的发生。Chen等的研究表明，miRNA-206与宫颈癌发生发展及患者的预后相关，被认为是一个潜在的宫颈癌诊断及治疗靶标。

miRNA-451位于人第17号染色体，是一种与细胞代谢密切相关的miRNA，具有抑制多种肿瘤发生发展的作用，被认为是一种潜在的抗肿瘤治疗的生物标志物。研究表明，miRNA-451能够靶向调控PI3K/AKT/雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，MTOR）信号通路，从而抑制多种肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移过程，在肿瘤诊断、病情监测及靶向治疗方面有巨大的应用价值。

本研究结果显示，宫颈癌患者宫颈癌组织中miRNA-451的相对表达量明显低于癌旁正常组织，且与宫颈癌患者的FIGO分期、淋巴结转移情况及分化程度可能有关，表明miRNA-451可能有抑制宫颈癌发生发展的作用。因此，进一步进行体外细胞实验探讨miRNA-451过表达对宫颈癌Hela细胞增殖与凋亡的影响及可能的机制，结果表明，转染后，miRNA-451-mimics组宫颈癌Hela细胞的存活率明显降低，miRNA-451过表达能够将宫颈癌Hela细胞的周期阻滞于G/G期并明显促进细胞凋亡。AKT是一种重要的调节分子，与细胞增殖分化、能量代谢及恶性肿瘤发生发展等多种过程密切相关。Zhang等的研究结果表明，宫颈癌的发生发展过程中，AKT的表达水平明显升高，与宫颈癌发生发展及不良预后明显相关。Bcl-2是AKT下游重要的抗凋亡蛋白，与多种肿瘤发生及恶性转化密切相关。本研究结果表明，miRNA-451-mimics瞬时转染能够明显降低宫颈癌Hela细胞中p-AKT、Bcl-2蛋白的相对表达量，表明miRNA-451能够通过抑制p-AKT、Bcl-2蛋白的表达，抑制宫颈癌Hela细胞的增殖并诱导其凋亡。由此可见，miRNA-451在宫颈癌组织中低表达，且与宫颈癌患者FIGO分期、淋巴结转移、分化程度相关，其过表达能通过阻断AKT/Bcl-2信号通路来抑制宫颈癌细胞的增殖并诱导其凋亡。

综上所述，miRNA-451能够通过阻断AKT/Bcl-2信号通路，抑制宫颈癌Hela细胞的增殖并诱导其凋亡，从而抑制宫颈癌的发生发展过程，有可能成为宫颈癌临床诊断、病情监测及靶向治疗的生物标志物。