血管内皮生长因子、神经元特异性烯醇化酶及可溶性B7家族成员H4在小儿恶性淋巴瘤中的表达及诊断价值

李慧，刘晶

1西北妇女儿童医院儿童血液肿瘤科，西安 710003

2宝鸡市妇幼保健院儿童医院儿童感染科，陕西 宝鸡 721000

恶性淋巴瘤是起源于淋巴造血组织的一种实体肿瘤，以无痛性的淋巴结肿大为主要表现，可伴有发热、消瘦等症状。恶性淋巴瘤可发生于任何年龄段，但近年来，小儿恶性肿瘤的发病率呈逐年上升趋势。研究发现，淋巴瘤组织中存在多种异常增殖因子，如血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、神经元特异性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）、可溶性B7家族成员 H4（soluble B7 family member H4，sB7-H4）等。但目前国内有关VEGF、NSE及sB7-H4与小儿恶性淋巴瘤相关性的研究报道较为少见。因此，本研究检测VEGF、NSE及sB7-H4在小儿恶性淋巴瘤中的表达情况，分析其对小儿恶性淋巴瘤的诊断价值，旨在为小儿恶性淋巴瘤的诊治提供参考，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年6月至2020年12月西北妇女儿童医院收治的恶性淋巴瘤患儿。纳入标准：①符合恶性淋巴瘤的诊断标准；②未经正规治疗，且近3个月内无药物服用史；③临床和随访资料完整。排除标准：①合并急性心梗死、脑出血等急性危重疾病；②合并凝血功能障碍；③合并重度脂肪肝、肝肾功能重度不全。依据纳入和排除标准，本研究共纳入54例恶性淋巴瘤患儿，其中男31例，女23例；年龄1～13岁，平均（6.48±1.13）岁；病理类型：霍奇金淋巴瘤19例，非霍奇金淋巴瘤35例；临床分期：Ⅰ期7例，Ⅱ期11例，Ⅲ期21例，Ⅳ期15例。取54例恶性淋巴瘤患儿的淋巴瘤组织和距肿瘤组织3 cm处的正常组织。

1.2 免疫组化法检测VEGF、NSE及sB 7-H 4蛋白的表达情况

取54例恶性淋巴瘤患儿的淋巴瘤组织和距肿瘤组织3 cm处的正常组织，立即用10%甲醛固定，65℃烤片20 min后常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，阻断灭活内源性过氧化物酶，置于pH=6.0的缓冲液中煮沸（95℃，15～20 min），自然冷却20 min以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）冲洗3次，每次5 min，进行抗原修复。滴加一抗4℃冰箱孵育过夜，PBS冲洗3次，每次5 min（用PBS代替一抗作为阴性对照，一抗稀释比例均为1∶100）。滴加生物素标记的二抗，37℃孵育30 min，PBS冲洗3次，每次5 min；滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37℃孵育30 min，PBS冲洗3次，每次5 min；二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）/过氧化氢反应染色，自来水充分冲洗后，苏木素复染，常规脱水，透明，干燥，封片。

1.3 结果判定

VEGF主要定位于细胞质，NSE主要定位于细胞质或细胞核，sB7-H4主要定位于细胞质或细胞膜，根据阳性细胞所占比例和染色强度进行评分。阳性细胞所占比例：无阳性细胞为0分，＜10%为1分，10%～50%为2分，＞50%为3分；染色强度：无着色为0分，淡黄色染色为1分，棕黄色染色为2分，棕褐色染色为3分。将阳性细胞所占比例评分和染色强度评分相乘，总分≥3分为阳性，＜3分为阴性。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 VEGF、NSE及sB 7-H 4表达情况的比较

恶性淋巴瘤组织中VEGF、NSE及sB7-H4阳性表达率均明显高于正常组织，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表1）

表1 不同组织中VEGF、NSE及sB 7-H 4阳性表达情况的比较[n（%）]

2.2 不同临床特征恶性淋巴瘤患儿淋巴瘤组织中VEGF、NSE及sB 7-H 4表达情况的比较

不同年龄、性别、病理类型和恶性程度恶性淋巴瘤患儿淋巴瘤组织中VEGF、NSE及sB7-H4阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；临床分期为Ⅲ～Ⅳ期的恶性淋巴瘤患儿淋巴瘤组织中VEGF、NSE及sB7-H4阳性表达率均高于Ⅰ～Ⅱ期患儿，差异均有统计学意义（χ=7.422、6.400、7.269，P＜0.05）。（表2）

表2 不同临床特征恶性淋巴瘤患儿淋巴瘤组织中VEGF、NSE及sB 7-H 4表达情况（n=54）

2.3 VEGF、NSE、sB 7-H 4单独及联合检测对小儿恶性淋巴瘤的诊断价值

ROC曲线结果示，VEGF、NSE、sB7-H4单独检测诊断小儿恶性淋巴瘤的AUC分别为0.632、0.731、0.674，VEGF+NSE+sB7-H4联合检测的AUC为0.805，明显高于单独检测。（表3、图1）

图1 VEGF、NSE、sB 7-H 4单独及联合检测小儿恶性淋巴瘤的ROC曲线

表3 VEGF、NSE、sB 7-H 4单独及联合检测对小儿恶性淋巴瘤的诊断价值

3 讨论

目前有关恶性淋巴瘤发病机制尚未明确，可能与环境、感染等有关。近年来，恶性淋巴瘤的发病率呈逐年上升和年轻化趋势，对患者身心健康可造成一定影响，早期诊断治疗对改善恶性淋巴瘤患者的预后有重要意义。因此，本研究探讨VEGF、NSE及sB7-H4在小儿恶性淋巴瘤中的表达情况，旨在为恶性淋巴瘤的早期诊断治疗提供参考。

VEGF又称为血管通透因子，具有增加促进血管通透性、促进细胞增殖和肿瘤新生血管生成等作用。本研究结果显示，42.59%的恶性淋巴瘤组织中VEGF表达阳性，高于正常组织；且临床分期为Ⅲ～Ⅳ期的恶性淋巴瘤患儿淋巴瘤组织中VEGF阳性表达率高于Ⅰ～Ⅱ期患儿，表明VEGF的表达可能与恶性淋巴瘤的进展有关。但Navone等的研究发现，VEGF表达与恶性淋巴瘤病理类型、年龄有关，与本研究报道不符，这可能与纳入病例数不同、地域差异等有关。

NSE是一种普遍存在于哺乳动物中的糖酵解酶。目前，NSE主要作为神经系统损伤与小细胞肺癌的标志物。但随着研究的不断深入，已有多项研究报道了NSE与恶性淋巴瘤的关系。Oya等研究发现，NSE在小儿恶性淋巴瘤中的阳性表达率高于健康对照组。与本研究结果相符，临床分期为Ⅲ～Ⅳ期的恶性淋巴瘤患儿淋巴瘤组织中NSE阳性表达率高于Ⅰ～Ⅱ期患儿。表明NSE在恶性淋巴瘤发生、发展中有重要作用，可作为病情监测、疗效评估的有效指标。

B7-H4是一种新型的协同刺激分子。Podojil等研究发现，B7-H4以可溶性的形式分布于肿瘤患儿血清中。人B7-H4基因的mRNA大量分布于淋巴组织与非淋巴组织中，但其蛋白则不表达于大部分正常组织中。国内外研究发现，B7-H4在肝癌、胃癌等多种恶性肿瘤中高表达，且其表达上调与患儿的临床分期密切相关。本研究结果发现，与正常组织相比，淋巴瘤组织中sB7-H4的阳性表达率更高，且临床分期为Ⅲ～Ⅳ期的恶性淋巴瘤患儿淋巴瘤组织中sB7-H4阳性表达率高于Ⅰ～Ⅱ期患儿。表明sB7-H4有望成为新的恶性淋巴瘤监测的肿瘤标志物。

Katagiri等研究指出，部分因子可作为恶性淋巴瘤诊断、病情评估、疾病进展的敏感生物标志物。但国外相关研究发现，单一因子检测易造成误诊或漏诊，多主张多项指标联合检测。本研究通过ROC曲线分析结果显示，VEGF、NSE及sB7-H4单独检测均可有效诊断恶性淋巴瘤，但联合检测诊断小儿恶性淋巴瘤的AUC最大，与上述文献报道相符。但本研究纳入的样本量较小，有可能存在一定偏差，尚需要更大样本量、多中心的研究证实。

综上所述，VEGF、NSE及sB7-H4在恶性淋巴瘤中呈异常表达，三者联合检测并结合临床特征有助于提高恶性淋巴瘤的诊断效能。