液相色谱质谱对重组人生长激素-Fc(CHO 细胞)二硫键连接的确认

2021-10-20 08:24朱秋媚王宇刘涵富瑞丽刘莹刘景会顾建阳
中国生物制品学杂志 2021年10期
关键词:离子流二硫键胰酶

朱秋媚,王宇,刘涵,富瑞丽,刘莹,刘景会,顾建阳

长春生物制品研究所有限责任公司,吉林长春130062

二硫键(S-S 键)是通过蛋白质中两个半胱氨酸上的巯基(-SH)氧化而形成的,在稳定蛋白质构象和保持其活性方面起着重要作用[1]。重组人生长激素(recombinant human growth hormone,rhGH)-Fc 是由两个相对分子质量为22 125 的GH 与相对分子质量为50 280 的重链通过Linker 连接而成,重链之间通过两对链间二硫键形成同源二聚体[2]。抗体药物中二硫键的排布是对其结构特征的一种反映[3],因此,二硫键连接的确认成为rhGH-Fc 结构确认过程中非常重要的一环。

液相色谱质谱(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)作为一种分析工具,在蛋白质药物研发前期的结构表征、工艺优化、关键质量属性分析以及质量控制中有普遍应用[4],LC-MS 能够精确测定多肽及蛋白质的相对分子质量,且通过二级碎片信息可解析肽段的氨基酸序列[5],特别是蛋白质药物的二硫键确认和翻译后修饰分析,质谱的作用不可或缺[6]。基于质谱技术的分析方法能应用于蛋白质药物生产的各个阶段,提供蛋白质药物的一级序列信息(包括翻译后修饰)、高级结构分析以及构象研究等[7-8]。因此,本研究采用LC-MS 建立特异的方法,对rhGH-Fc 的二硫键进行解析。

1 材料与方法

1.1 样品 rhGH-Fc 为本公司制备。

1.2 主要试剂及仪器 盐酸胍购自美国Gibco 公司;碘乙酰胺(iodoacetamide,IAM)购自美国 Sigma公司;胰酶购自美国Promega 公司;乙腈(LC-MS 级)购自美国Honeywell 公司;甲酸(LC-MS 级)购自美国Fisher 公司;碳酸氢铵(分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司;超滤管购自美国Millipore 公司;AcQuity 液相色谱系统、色谱柱CSHC1(82.1 mm ×100 mm,130 Å,1.7 μm)、G2-XS 精确质量四级杆飞行时间(Q-TOF)液质联用系统和UNIFI 软件购自美国Waters 公司。

1.3 样品的制备 取 200 μL 样品,加入 600 μL 盐酸胍(8 mol / L),50 ℃水浴 0.5 h;取出放至室温,加入8 μL 碘乙酰胺(1 mol / L),避光 30 min;取上述样品加入超滤管中,13 201 × g 离心5 min,弃去滤过液,加入50 mmol / L NH4CO(3pH 8.0)缓冲液置换,离心操作10 次,最后用50 mmol / L NH4CO(3pH 8.0)缓冲液将蛋白浓度调节至0.3 mg / mL。分别按胰酶 ∶蛋白 1 ∶15 的比例加入胰酶,37 ℃酶解4 h。

1.4 液相色谱条件 色谱柱:CSHC1(82.1 mm×100 mm,130 Å,1.7 μm);流动相 A:100%水(含 0.1%甲酸);流动相B:100%乙腈(含0.1%甲酸);流速:0.3 mL/min;柱温:65 ℃;上样量:5 μL;梯度洗脱表见表 1。

表1 液相梯度洗脱表Tab.1 Gradient elution in LC

1.5 质谱条件 MSE采集模式;毛细管电压:2 500 V;Cone 电压:40 V;去溶剂气体温度:350 ℃;源温:120 ℃;去溶剂气体流速:600 L / h;一级质谱扫描范围:100 ~ 2 000 m / z。

2 结 果

确认到rhGH-Fc 中Fc 和rhGH 的正确二硫键连接。其中 1 ∶T6-1 ∶T16、1 ∶T20-1 ∶T21 为 rhGH 的链内二硫键,二硫键连接为:Cys53-Cys165,Cys182-Cys189,见图 1~ 图 6 和表 2。1 ∶T22-2 ∶T22 为 Fc 的链间二硫键,此肽段上有4 个半胱氨酸,形成2 组二硫键,二硫键连接为:1 ∶Cys210-2 ∶Cys210,1 ∶Cys213-2 ∶Cys213,见图 7~ 图 9 和表 2;1 ∶T24-1 ∶T29、1 ∶T36-1 ∶T41 为Fc 的链内二硫键,二硫键连接为:Cys245-Cys305,Cys351-Cys409,见图 10 ~ 图 15 和表 2。

图1 T6-T16 二硫键总离子流色谱图Fig.1 Chromatogram of total ion flow of T6-T16 disulfide bond

图6 T20-T21 二硫键的二级图谱Fig.6 Secondary profile of T20-T21 disulfide bond

图7 1 ∶T22-2 ∶T22 二硫键总离子流色谱图Fig.7 Chromatogram of total ion flow of 1 ∶T22-2 ∶T22 disulfide bond

图9 1 ∶T22-2 ∶T22 二硫键的二级图谱Fig.9 Secondary profile of 1 ∶T22-2 ∶T22 disulfide bond

图10 T24-T29 二硫键总离子流色谱图Fig.10 Chromatogram of total ion flow of T24-T29 disulfide bond

图15 T36-T41 二硫键的二级图谱Fig.15 Secondary profile of T36-T41 disulfide bond

表2 通过软件确认的各组合物二硫键Tab.2 Disulfide bonds in various compositions confirmed by software

图2 T6-T16 二硫键的一级图谱Fig.2 Primary profile of T6-T16 disulfide bond

图3 T6-T16 二硫键的二级图谱Fig.3 Secondary profile of T6-T16 disulfide bond

图4 T20-T21 二硫键总离子流色谱图Fig.4 Chromatogram of total ion flow of T20-T21 disulfide bond

图5 T20-T21 二硫键的一级图谱Fig.5 Primary profile of T20-T21 disulfide bond

图8 1 ∶T22-2 ∶T22 二硫键的一级图谱Fig.8 Primary profile of 1 ∶T22-2 ∶T22 disulfide bond

图11 T24-T29 二硫键的一级图谱Fig.11 Primary profile of T24-T29 disulfide bond

图12 T24-T29 二硫键的二级图谱Fig.12 Secondary profile of T24-T29 disulfide bond

图13 T36-T41 二硫键总离子流色谱图Fig.13 Chromatogram of total ion flow of T36-T41 disulfide bond

图14 T36-T41 二硫键的一级图谱Fig.14 Primary profile of T36-T41 disulfide bond

3 讨 论

本研究采用Waters QTof 液质联用仪对rhGHFc 的二硫键进行解析,确认rhGH-Fc 中rhGH 的二硫键连接为 Cys53-Cys165,Cys182-Cys189;rhGH-Fc中 Fc 的二硫键连接为 1 ∶Cys210-2 ∶Cys210,1 ∶Cys213-2 ∶Cys213,Cys245-Cys305,Cys351-Cys409,其中 1 ∶Cys210-2 ∶Cys210 和 1 ∶Cys213-2 ∶Cys213 为 Fc 的链间二硫键,其他为链内二硫键,与理论信息一致。表明具有高分辨率和高准确度的LC-MS 技术可有效对蛋白一级结构表征进行分析[9-12]。

hGH 由人脑垂体前叶的嗜酸性细胞分泌,含有191 个氨基酸分子,相对分子质量为22 125,具有种属特异性,是人类出生后促生长最重要的一种蛋白质类激素[13],正确的二硫键连接可影响其活性[14]。

Fc 片段是保持rhGH-Fc 在体内半衰期较长的主要因素,同时可影响蛋白稳定性[15]。由于rhGHFc 的链间二硫键易水解[16],易形成单体,影响其结构和稳定性,对Fc 片段的二硫键进行鉴定显得尤为重要。

rhGH-Fc 被胰酶酶切成不同分子量大小的肽段,有半胱氨酸的肽段通过-S-S-连接成两个肽段,经质谱检测后能够获得含有-S-S-肽段的总离子流色谱图(total ion chromatograms)、肽段一级图谱和二级图谱,通过软件对这些肽段的图谱进行数据分析,鉴定到二硫键连接的位点。本研究无需对样品进行额外的标记,裸露出来的巯基可通过IAM 封闭,避免样品处理过程中产生错配的二硫键,且二硫键连接肽段无N 糖位点,仅通过对样品的酶解肽段进行分析,即可实现对样品二硫键连接的确认。

综上所述,本方法简单易用,能够快速、准确、有效地的确认rhGH-Fc 二硫键连接,也为其他融合蛋白的二硫键分析提供了思路。

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