苏木乙酸乙酯提取物对肺动脉高压模型大鼠血清TXA2、PGI2及肺组织病理形态学的影响*

常艳宾 张丽丽 李 雁

（黑龙江省中医药科学院心五科，黑龙江 哈尔滨 150036）

肺动脉高压（Pulmonary arterial hypertension，PAH）是一种病变累及肺动脉血管内皮细胞、肌层以及外膜而使肺动脉血流受限，导致肺血管阻力（Pulmonaryvascular resistance，PVR）进行性升高为主要特征，血流动力学异常致使右心负荷增大、右心功能不全，进而右心室肥厚扩张的一类恶性心脏血管性疾病[1-3]。PAH 患者大多数以活动耐力下降为首发症状，预后差，其致残率及病死率都很高，是目前医疗卫生急需解决的重要问题之一，其可以发展为难治性右心衰竭，并且其他类心脏疾病也可以在病程中晚期合并PAH，预后更为恶劣。目前临床对PAH 的治疗药物主要有：前列环素类药物、内皮素受体拮抗剂、一氧化氮（NO）、5 型磷酸二酯酶（PDE-5）抑制剂等，但由于费用昂贵，给患者带来了沉重的经济负担。外科治疗主要有房间隔造口术、肺移植等，手术风险大，适用范围小，只能作为治疗PAH 的最后手段。而且术后需终身口服免疫抑制剂等一系列术后问题及相关并发症。因此，在PAH 的治疗上仍需开发新型药物。

PAH 主要的病理生理改变是内皮功能障碍，导致肺血管收缩，最终产生肺动PAH。肺血管重塑、肺小动脉狭窄导致肺循环阻力增加，右心负荷增大，最终导致右心功能衰竭，是目前国内外专家学者关于PAH 比较认可的发病机制。既往研究表明苏木有免疫抑制、抗炎、抗动脉粥样硬化、抑制心肌细胞凋亡、增强心肌收缩力、稳定斑块、保护心肌组织等作用[4-8]。但苏木对PAH 是否具有防治作用及作用机制尚不明确。故本研究通过腹腔注射野百合碱（MCT）建立PAH 大鼠模型，观察苏木乙酸乙酯提取物对MCT 致PAH 模型大鼠保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 SD 大鼠，雄性，体质量（200±20）g，购自黑龙江中医药大学实验动物中心。实验动物饲养按卫生部发布的实验动物管理指南执行，在通风、温度及湿度适宜的环境下自由摄食、饮水。

1.1.2 实验药物 苏木乙酸乙酯提取物采用超声振荡提取法提取，由黑龙江中医药大学制剂室制备提供，用苏木乙酸乙酯提取物溶于羧甲基纤维素钠溶液，配制成浓度为73.6 mg/mL（低浓度）和147.2 mg/mL（高浓度）的药液，现用现配。阿魏酸钠购于黑龙江省哈尔滨博润生物公司（纯度为97%），用纯度为97%阿魏酸钠粉末9 g 溶于300 mL 羧基纤维素钠溶液中，配制成浓度为30 mg/mL的溶液。

1.1.3 主要试剂及仪器 野百合碱（C240l-600 mg；购自sigma 公司，USA）；苏木精-尹红染色液（北京，biosharp 公司），大鼠血栓素A2 试剂盒（黑龙江省哈尔滨博润生物公司，批号：R-D140305），前列环素试剂盒（黑龙江省哈尔滨博润生物公司批号：R-D140305），雷杜酶标仪RT-6100（美国雷杜公司），光学显微镜（日本OLYMPUS 公司），Q5100W 病理图像分析系统（德国LEICA公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 PA H 模型复制 将MCT 用2∶8 的无水乙醇和生理盐水混合液配成为1%的溶液，按照60 mg/kg 一次性腹腔注射。

1.2.2 实验分组与给药方法 采用完全随机化的分组方法，将50 只雄性SD 大鼠随机分为5 组（每组10 只）。空白组：第1 天腹腔注射生理盐水10 mL/kg，第15 天开始给予羧甲基纤维素钠溶液10 mL/（kg·d）灌胃。其他4组第1 天腹腔注射MCT60 mg/kg，第15 天开始，模型组给予羧甲基纤维素钠溶液10 mL/（kg·d）灌胃；苏木乙酸乙酯提取物高剂量组（高剂量组）给予高浓度苏木乙酸乙酯提取物10 mL/（kg·d）（相当于生药量2.3 g/kg）灌胃；苏木乙酸乙酯提取物低剂量组（低剂量组）给予低浓度苏木乙酸乙酯提取物10 mL/（kg·d）（相当于生药量1.15 g/kg）灌胃。对照组给予阿魏酸钠10 mL/（kg·d）灌胃。以上至实验第28 天最后1 次灌胃，实验期满后进行相关检查、处死大鼠，肺脏固定于10%中性福尔马林缓冲液，常温保存备用。

1.3 观察指标

1.3.1 血清血栓素A 2（TX A 2）、前列环素（PG I2）测定 完成血流动力学测定后，用真空冷却抗凝试管从腹主动脉中抽取血液，于低温离心机3500 r/min 离心（离心半径13.5 cm）后，分离血清，-20 ℃以下贮存待测。

1.3.2 H E 染色观察病理形态学变化 将肺脏固定于10%中性福尔马林缓冲液，经脱水，包埋，切片，染色，封片，光学显微镜检测，观察肺小动脉形态学改变。

1.4 统计学方法 所有数据均运用SPSS 18.0 分析软件进行统计学分析。所有数据以均数±标准差（）表示，多样本均数之间比较运用方差分析，组间两两比较采用q 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 实验期间，空白组大鼠呼吸平稳，活泼好动，皮毛光亮，体质量逐渐增加。其他组腹腔注射MCT 7 d 后，活动减少，倦卧，食量减少，第14 天开始出现皮毛枯槁，蜷缩，活动逐渐减少，出现喘息，体质量增加明显减慢；模型组第21 天出现鼻部及唇周紫绀，大鼠出现死亡；对照组，高、低剂量组在第15 天开始给药，20 d 后对照组，高、低剂量组大鼠精神状态开始好转，活动量逐渐增多，毛发较前光整，呼吸喘息减轻，食量及体质量增加。大鼠腹腔注射MCT 28 d 后，空白组10 只均存活（存活率100%），模型组有5 只存活（存活率100%），高剂量组和对照组均有8 只存活（存活率80%），低剂量组有9 只存活（存活率90%）。其中模型组有2 只大鼠、高剂量组有1 只大鼠和对照组2 只大鼠有不同程度的胸水和（或）腹水。

2.2 肺组织及肺血管病理形态学 空白组肺动脉壁清晰，小动脉管壁内皮细胞扁平连续，厚薄较为一致，血管周围无炎性细胞浸润（见图1A）；模型组大鼠肺泡少量出现浆液性渗出，局部伴有炎性细胞浸润，肺小动脉壁增生，尤以平滑肌层增生最为显著，管腔变窄，血管内皮细胞变成不规则形状，致使血管内皮粗糙，血管内有浆液性渗出，并伴有充血，支气管腔内有少量浆液性渗出（见图1B）；对照组肺脏的肺泡内出现大面积的浆液性渗出，渗出物呈现淡粉色，其中混有少量的红细胞以及脱落的肺泡上皮细胞，局部伴有炎性细胞浸润，肺小动脉扩张充血，小动脉壁厚度与模型组相比明显变薄，但与空白组相比增厚明显（见图1E）；高剂量组和低剂量组肺小动脉壁厚度差异不大，高剂量组、低剂量组与空白组增厚明显，但厚度介于模型组与对照组之间而优于对照组（见图1C、图1D）。

图1 各组大鼠肺血管病理切片图（H E×100）

2.3 血清TX A 2 水平 与空白组比较，模型组、高剂量组、低剂量组和对照组血清TXA2 水平显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，高剂量组、低剂量组和对照组血清TXA2 水平显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；高剂量组与低剂量组相比，低剂量组血清TXA2 水平较低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠血清TXA2水平的比较（，pg/mL）

表1 各组大鼠血清TXA2水平的比较（，pg/mL）

注：与空白组对比，△P<0.05；与模型组对比，▲P<0.05；与高剂量组相比，★P<0.05。

2.4 血清PG I2 水平 与空白组比较，模型组、高剂量组、低剂量组和对照组血清PGI2 水平显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，高剂量组、低剂量组和对照组血清PGI2 水平显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；高、低剂量组与对照组之间血清PGI2 水平相互比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），高剂量组与低剂量组优于对照组，且高剂量组优于低剂量组。见表2。

表2 各组大鼠血清PGI2水平的比较（，pg/mL）

表2 各组大鼠血清PGI2水平的比较（，pg/mL）

注：与空白组对比，△P<0.05；与模型组对比，▲P<0.05；与对照组相比，★P<0.05。

3 讨论

PAH 的主要病理改变为肺血管结构重构，病理学特点主要表现为：肺动脉中膜肥厚、内膜增生及特征性丛样病变。组织学研究表明重构的肺动脉周围发生了明显的炎症细胞浸润。本次研究模型组大鼠肺泡少量出现浆液性渗出，局部伴有炎性细胞浸润，肺小动脉壁增生，尤以平滑肌层增生最为显著，管腔变窄，血管内皮细胞变成不规则形状，致使血管内皮粗糙，血管内有浆液性渗出，并伴有充血，支气管腔内有少量浆液性渗出，说明模型组大鼠存在肺血管重构，产生明显炎症反应。苏木乙酸乙酯提取物高、低剂量组大鼠肺泡浆液性渗出明显减少，局部炎性细胞浸润较轻，肺小动脉壁增生及管腔变窄程度较模型组明显改善，说明苏木乙酸乙酯提取物可有效逆转肺血管的重塑及抑制炎性渗出。既往研究[6，9-12]表明，苏木乙酸乙酯提取物可有效升高血清IL-1β、IL-4、IL-10，抑制IL-6 的分泌，调整T 细胞亚群及促进细胞毒性T 淋巴细胞的凋亡，具有较好的免疫抑制作用，可有效抑制肺动脉周围炎症细胞浸润，可有效降低肺动脉压力。因此，苏木乙酸乙酯提取物逆转PAH 肺血管重构，抑制炎症反应可能是通过其免疫抑制作用达到治疗作用。

PGI2 和TXA2 是血管内皮细胞产生的花生四烯酸代谢物。PGI2 有很强地松弛血管平滑肌扩张血管、抑制血小板凝聚、抑制血管平滑肌细胞增殖作用，与PAH 的形成及发展密切相关[13]；而TXA2 是一种血管内皮细胞和血小板产生的血管收缩剂，可引起血小板凝聚。肺血管内皮细胞损伤将使PGI2 分泌下降，从而使血管紧张度增高，平滑肌细胞增生，同时促进血小板黏附、激活，有利于血栓形成及血栓素分泌的增加，促成并加剧肺动脉高压[14]。在PAH 患者的尿检里，PGI2 代谢物水平降低，而TXA2 的代谢物水平升高。因此，研制具有升高PGI2而抑制TXA2 的药物对治疗PAH 具有广泛前景。本研究中苏木乙酸乙酯提取物能使血清TXA2 明显降低，PGI2 水平明显升高。本研究的同期实验研究显示苏木乙酸乙酯提取物能够明显降低PAH 模型大鼠的肺动脉压力，说明苏木乙酸乙酯提取物可能是通过降低血清TXA2 水平，减轻TXA2 收缩血管的作用，而升高PGI2 水平，扩张血管、抑制血小板、抗细胞增殖，从而降低肺动脉压力。

综上所述，苏木乙酸乙酯提取物对MCT 诱导的PAH大鼠具有防治作用。苏木乙酸乙酯提取物可通过逆转PAH 大鼠的肺血管重构，降低血清TXA2 水平，恢复内皮功能，减轻肺动脉阻力，达到降低肺动脉压力的目的。关于苏木乙酸乙酯提取物对PAH 是如何恢复内皮功能，逆转肺血管重构，降低血清TXA2 水平，发挥治疗作用，是否存在其他的作用机制及途径，有待进一步的研究探讨。