miR-155对兔鼻窦炎骨质重塑和Notch-1及DLL4的影响

杨志超，于 洋，马会梅，朱金源，梁 鹏，高小平

（1.宁夏医科大学总医院耳鼻咽喉头颈外科，银川 750004；2.宁夏医科大学总医院重症医学科，银川 750004；3.宁夏医科大学，银川 750004）

慢性鼻窦炎是耳鼻咽喉科常见疾病之一，是发生在鼻窦的慢性化脓性炎症，可引发哮喘、慢性阻塞性肺疾病等呼吸道感染并发症，具有发病率高、迁延不愈、反复发作的特点，已经成为现代社会严重的公共健康问题[1-2]。骨质重塑是该病重要的病理特征，主要表现为鼻窦骨壁骨质吸收和新骨形成，造成骨质破坏、结构不连续以及骨质增生硬化等病理改变[3-4]。炎性反应是导致鼻窦黏膜组织损伤及骨壁骨质重塑的主要病理因素，破骨细胞在炎症环境下激活，引发骨重建[5-6]，在膝关节炎的病情进展过程中，高水平炎性因子引发严重的炎性反应，导致膝关节负荷增加，从而升高骨保护蛋白（osteoprotegerin，OPG）水平，增强骨重建[7]。Notch信号通路是调控机体炎性反应的重要信号通路，可募集白细胞到炎症部位，引发炎性反应，下调该信号通路表达可抑制炎症表达，导致成骨及破骨细胞成熟过程停滞，减弱骨重建[8-9]。由此可知，Notch信号是减轻鼻窦炎骨质重塑的潜在靶点。miR-155是高度保守的miRNA，广泛表达于脊椎动物中，可促使促炎因子合成，抑制抗氧化基因表达，导致炎症发生发展，miR-155在中枢神经系统炎性疾病中表达增加，下调其表达可抑制炎症，减轻脑损伤[10]，但miR-155对鼻窦炎模型兔Notch信号通路及鼻窦骨质重塑的影响目前还不清楚，本研究通过构建鼻窦炎模型兔，对此进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 新西兰兔购自广州市白云区龙归兴科动物养殖场，体质量2.5～3 kg，雌雄不限，许可证号：SCXK（粤）2017-0042。在本院动物房中饲养，自由饮水、摄食，自然光照，温度25℃，适应饲养1周后进行实验。

1.1.2 主要试剂 金黄色葡萄球菌标准株（宁波明舟生物科技有限公司，货号：B90581）；miR-155 antagomir（上海吉玛制药技术有限公司）；miR-155、U6、Notch-1、DLL4、磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）引物（上海生工生物工程技术服务有限公司）；TRAP/ALP双重染色试剂盒（上海宇劲生物技术有限公司，货号：294-67001）；兔OPGELISA试剂盒（上海圻明生物科技有限公司，货号：mEA-R31609）；山羊源Notch-1、DLL4一抗（上海优宁维生物科技股份有限公司，货号：MAB3647、AF1389）；兔RANKL、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒，兔源GAPDH一抗、驴抗山羊二抗、羊抗兔二抗（美国Abcam公司，货号：ab100749、ab100772、ab100785、ab181602、ab6885、ab150077）；苏木精-伊红（HE）染色试剂盒[生工生物工程（上海）股份有限公司，货号：E607218-0200］；RNAiso Plus、逆转录试剂盒、荧光定量聚合酶链反应（PCR）试剂盒（美国Takara公司，货号：9108、RR037Q/A/B、639519）；蛋白裂解液、二喹啉甲酸蛋白定量分析（BCA）试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，货号：P0013K、P0011等）。

1.1.3 主要仪器 Eclipse E200实验室教学生物显微镜（日本尼康公司）；LCT200 Micro-CT小动物活体影像系统[汇佳生物股份（中国）有限公司］；RM2235石蜡切片机（德国Leica公司）；Elx800酶标仪、1659001蛋白电泳仪、Trans-Blot SD半干转膜仪（美国Bio-Rad公司）；3900型高通量DNA合成仪（美国应用生物系统公司）；CFX96 Touch Deep Well荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad公司）；2500凝胶成像系统（上海天能科技有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的建立及分组 新西兰兔共32只，随机分为假手术组、模型组、miR-155 antagomir组、miR-155 antagomir阴性对照组，每组8只。除假手术组外，其余各组参照文献[11]中的方法构建鼻窦炎模型：采用生理盐水将金黄色葡萄球菌制成108CFU·mL-1的混悬液备用。以2.5%戊巴比妥钠0.8 mL·kg-1经耳缘静脉注射麻醉，然后于鼻背正中线右侧0.5 cm处纵行切开长1～1.5 cm切口，分离皮下组织及骨膜，于上颌窦前壁开直径3 mm大小的孔，取适量无菌棉球，在内镜直视下由上颌窦内部不完全堵塞上颌窦口；用1 mL注射器抽取0.3 mL细菌混悬液注入窦口处的棉絮及上颌窦腔，然后将骨膜、皮下组织和皮肤逐层缝合，再用乙醇消毒伤口。假手术组注入等剂量生理盐水替代细菌混悬液，其他操作相同。建模同时，参照说明书及文献[12]：用生理盐水溶解miR-155 antagomir、miR-155 antagomir阴性对照，分别配制成终浓度为15 nmol·L-1的溶液，以50μL·kg-1的剂量尾静脉注射，假手术组和模型组腹腔注射等量生理盐水，1次/d，共注射3次。

1.2.2 兔鼻部症状评分 给药结束24 h后，观察兔鼻部症状，参照文献[11]中标准进行评分，见表1。

表1 兔鼻部症状评分标准

1.2.3 鼻窦骨壁结构骨质重塑活性检测及标本采集 兔鼻部症状评分结束后，使用Micro-CT小动物活体影像系统对各组兔鼻窦进行连续CT扫描，层与层间距1 mm，分骨窗（窗宽2 000，窗位200）、软组织窗（窗宽350，窗位50）扫描，获得矢状位影像。各组兔按照1.2.1中方法麻醉后处死，采集腹主动脉血5 mL，静置后离心15 min（3 000 r·min-1，4℃），收集上清（血清）冻存于-80℃备用；解剖取出鼻窦组织，剪取约1 g冻存于-80℃备用；分离出鼻窦骨壁组织及黏膜组织，骨壁组织及黏膜组织经漂洗、脱钙、固定、脱水、透明、石蜡包埋后，以切片机做连续病理切片。每只兔选出3张骨壁组织切片然后经脱蜡、梯度乙醇依次浸泡（由高到低）后，做TRAP/ALP双重染色，操作步骤参照试剂盒说明书进行，再次脱水、透明后封片，以光学显微镜观察破骨细胞活化及成骨分化情况，进行骨质重塑活性评分[13-14]。无重塑活性（1分）：鼻窦骨壁结构无变化，无骨形成及骨吸收；轻度重塑活性（2分）：鼻窦骨质稍有增厚，局部骨吸收；重度重塑活性（3分）：鼻窦骨质明显增厚，成骨细胞活性明显，且有数量众多的骨吸收陷窝。

1.2.4 HE染色观察鼻窦黏膜组织病理变化 按照1.2.3中将鼻窦黏膜组织切片脱蜡后以梯度乙醇浸泡（由高到低），进行HE染色，具体操作参照试剂盒说明书，经漂洗、脱水、透明后封片，在光学显微镜下观察鼻窦黏膜组织病理变化情况并进行炎症评分[14]：正常黏膜组织、无明显炎症为0分；视野内有少量炎性细胞、轻度炎症为1分；视野内有较多炎性细胞、中度炎症为2分；视野内充满众多炎性细胞、显著/严重炎症为3分。

1.2.5 ELISA法测定血清TNF-α、IL-6、OPG及破骨细胞分化因子（RANKL）水平 将1.2.3中血清置于冰水浴中解冻，用ELISA法测定其中TNF-α、IL-6、OPG及RANKL水平，具体操作参照试剂盒说明书。

1.2.6 实时荧光定量PCR检测鼻窦组织中Notch信号通路相关因子mRNA及miR-155表达 取1.2.3中冻存鼻窦组织约0.5 g，剪碎后置于1 mL RNAiso Plus中提取总RNA，具体步骤参照RNAiso Plus说明书，然后将总RNA逆转录为cDNA并进行荧光定量PCR反应，具体步骤参照各自试剂盒说明书，内参基因为U6、GAPDH，以2-ΔΔCt法对结果进行分析，得出各组Notch-1、DLL4 mRNA及miR-155表达量，引物序列见表2。

表2 引物序列

1.2.7 免疫印迹检测鼻窦组织中Notch信号通路相关因子蛋白表达 将1.2.3中剩余鼻窦组织剪碎后置于蛋白裂解液中，冰浴中匀浆得到匀浆液，离心20 min（3 000 r·min-1，4℃），收集上清，以二喹啉甲酸蛋白定量分析法（BCA）测定蛋白总浓度（具体操作参照试剂盒说明书），100℃5 min变性，各取20μg蛋白上样进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），蛋白分离后湿转至硝酸纤维膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，以Notch-1、DLL4一抗（均稀释2 000倍）4℃孵育过夜，TBST溶液漂洗，驴抗山羊二抗室温孵育2 h，TBST溶液漂洗，ECL发光液显色，采用Tanon软件拍摄蛋白条带，并以Image J软件分析蛋白相对表达量。

1.3 统计学方法

以软件SPSS 22.0对数据进行统计学分析。计量数据以均数±标准差（±s）表示，多组间比较行单因素方差分析，组内两两比较行LSD-t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组兔鼻部症状和鼻窦黏膜病理变化比较

与假手术组比较，模型组兔鼻窦黏膜结构紊乱，固有层可见大量炎性细胞浸润，纤毛脱落严重，呈现明显的病理损伤，鼻部症状评分及炎症评分均升高（P均＜0.05）。与模型组比较，miR-155 antagomir组兔鼻窦黏膜病理损伤减轻，鼻部症状评分及炎症评分均降低（P均＜0.05）；miR-155 antagomir阴性对照组兔鼻窦黏膜病理损伤无明显改变，鼻部症状评分及炎症评分无明显变化（P均＞0.05），见图1、表3。

表3 各组兔鼻部症状评分（±s，分）

表3 各组兔鼻部症状评分（±s，分）

与假手术组比较aP＜0.05；与模型组比较bP＜0.05。

组别 n 鼻部症状评分 鼻窦黏膜炎症评分假手术组 8 0.00±0.00 0.00±0.00模型组 8 2.43±0.38a 2.56±0.38a miR-155 antagomir阴性对照组 8 2.39±0.43 2.47±0.45 miR-155 antagomir组 8 0.32±0.04b 0.28±0.03b F值 164.90 174.30 P值 ＜0.001 ＜0.001

图1 各组兔鼻窦黏膜病理变化（HE×200）

2.2 各组兔鼻窦骨壁结构骨质重塑活性比较

与假手术组比较，模型组兔鼻窦窦腔积液，骨质明显增厚，成骨细胞活性明显，骨质重塑活性评分及骨吸收陷窝升高（P＜0.05）。与模型组比较，miR-155 antagomir组兔鼻窦骨质增生不明显，无明显骨形成及骨吸收，骨质重塑活性评分降低（P＜0.05）；miR-155 antagomir阴性对照组兔鼻窦窦腔积液，骨质增生，成骨细胞活跃，骨质重塑活性评分无明显变化（P＞0.05），见图2、图3、表4。

表4 各组兔鼻窦骨壁结构骨质重塑活性评分（±s，分）

表4 各组兔鼻窦骨壁结构骨质重塑活性评分（±s，分）

与假手术组比较aP＜0.05；与模型组比较bP＜0.05。

组别 n 骨质重塑活性评分假手术组 8 1.00±0.00模型组 8 2.62±0.35a miR-155 antagomir阴性对照组 8 2.54±0.39 miR-155 antagomir组 8 1.08±0.25b F值 75.25 P值 ＜0.001

图2 兔鼻窦骨壁结构CT影像（矢状位）

图3 TRAP和ALP双重染色观察兔鼻窦骨壁结构骨质重塑情况（×200）

2.3 各组兔血清TNF-α、IL-6、OPG、RANKL水平比较

与假手术组比较，模型组兔血清炎症因子TNF-α、IL-6、OPG、RANKL水平均升高（P均＜0.05）。与模型组比较，miR-155 antagomir组兔血清TNFα、IL-6、OPG、RANKL水平均降低（P均＜0.05）；miR-155 antagomir阴性对照组兔血清TNF-α、IL-6、OPG、RANKL水平无明显变化（P均＞0.05），见表5。

表5 各组兔血清TNF-α、IL-6、OPG、RANKL水平比较（±s）

表5 各组兔血清TNF-α、IL-6、OPG、RANKL水平比较（±s）

与假手术组比较aP＜0.05；与模型组比较bP＜0.05。

组别 n TNF-α/（ng·mL-1） IL-6/（ng·mL-1） OPG/（ng·mL-1） RANKL/（pg·mL-1）假手术组 8 2.73±0.20 2.11±0.18 2.43±0.29 20.86±2.10模型组 8 6.12±0.49a 5.03±0.44a 4.98±0.48a 36.67±3.53a miR-155 antagomir阴性对照组 8 6.18±0.50 5.11±0.48 5.03±0.54 36.80±3.18 miR-155 antagomir组 8 2.94±0.23b 2.24±0.25b 2.58±0.19b 21.11±3.05b F值 201.50 172.50 104.00 72.93 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.4 各组兔鼻窦组织Notch信号通路相关因子mRNA及miR-155表达比较

与假手术组比较，模型组兔鼻窦组织miR-155表达水平、Notch-1及DLL4 mRNA表达水平均升高（P均＜0.05）。与模型组比较，miR-155 antagomir组兔鼻窦组织miR-155表达水平、Notch-1及DLL4 mRNA表达水平均降低（P均＜0.05）；miR-155 antagomir阴性对照组兔鼻窦组织Notch-1、DLL4 mRNA及miR-155表达水平无明显变化（P均＞0.05），见表6。

表6 各组兔鼻窦组织Notch信号通路相关因子mRNA及miR-155相对表达（±s）

表6 各组兔鼻窦组织Notch信号通路相关因子mRNA及miR-155相对表达（±s）

与假手术组比较aP＜0.05；与模型组比较bP＜0.05。

组别 n miR-155 Notch-1 DLL4假手术组 8 0.99±0.21 1.03±0.22 1.01±0.19模型组 8 2.58±0.64a 2.45±0.34a 2.69±0.37a miR-155 antagomir阴性对照组 8 2.61±0.65 2.58±0.38 2.63±0.41 miR-155 antagomir组 8 1.09±0.15b 1.15±0.25b 1.13±0.12b F值 28.76 58.85 76.12 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.5 各组兔鼻窦组织Notch信号通路相关因子蛋白表达比较

与假手术组比较，模型组兔鼻窦组织Notch-1、DLL4蛋白表达水平均升高（P均＜0.05）。与模型组比较，miR-155 antagomir组兔鼻窦组织Notch-1、DLL4蛋白表达水平均降低（P均＜0.05）；miR-155 antagomir阴性对照组兔鼻窦组织Notch-1、DLL4蛋白表达水平均无明显变化（P均＞0.05），见图4、表7。

图4 免疫印迹检测各组兔鼻窦组织Notch信号通路相关因子蛋白表达水平

表7 各组兔鼻窦组织Notch信号通路相关因子蛋白相对表达（±s）

表7 各组兔鼻窦组织Notch信号通路相关因子蛋白相对表达（±s）

与假手术组比较aP＜0.05；与模型组比较bP＜0.05。

组别 n Notch-1 DLL4假手术组 8 0.11±0.02 0.09±0.01模型组 8 0.85±0.14a 0.70±0.13a miR-155 antagomir阴性对照组 8 0.82±0.10 0.68±0.15 miR-155 antagomir组 8 0.14±0.03b 0.11±0.02b F值 174.30 93.17 P值 ＜0.001 ＜0.001

3 讨论

目前临床上有部分鼻窦炎患者经过规范化药物及手术治疗后，仍存在易复发、经久难愈的情况，已成为耳鼻喉科领域的重点和难点之一，因此探索该病的发病机制，找到更为有效的治疗方法具有一定临床意义[1-2，15]。骨质重塑是导致鼻窦炎迁延不愈、反复发作的主要原因之一，OPG和RANKL是分别调控成骨及破骨分化的细胞因子[7，16]。本研究以细菌感染上颌窦的方法构建鼻窦炎模型兔，结果显示，建模兔鼻部症状评分、鼻窦黏膜炎症评分、鼻窦骨壁结构骨质重塑活性评分、血清OPG及RANKL水平均升高，表明细菌感染可导致兔鼻窦组织严重的炎症损伤，引发鼻窦骨壁结构骨质重塑，造成鼻窦炎症状，提示模型建立成功。

鼻窦炎患者鼻窦部位的炎性反应，可导致骨壁结构骨质表面炎性细胞浸润，进而引发骨重建。研究发现，免疫系统参与调控骨重建过程，免疫细胞激活后大量合成、释放炎性因子，诱导破骨形成，促使成骨细胞成熟，进而促进骨再生及骨重塑[5-7，17-18]。miR-155是机体中调控炎性反应的一种miRNA，可激活炎症通路，促进炎症进展，在胰腺炎动物模型中，miR-155处于高表达水平，下调其表达可抑制炎性反应，减轻胰腺损伤[19]，因而推测miR-155可能介导鼻窦炎骨质重塑过程。本研究结果显示，鼻窦炎模型兔鼻窦组织miR-155表达水平升高，经miR-155 antagomir处理后，兔鼻窦组织miR-155表达水平降低，鼻部症状评分、鼻窦黏膜炎症评分、鼻窦骨壁结构骨质重塑活性评分、血清TNF-α、IL-6、OPG及RANKL水平亦降低，表明miR-155参与调控鼻窦炎骨质重塑，下调其表达可抑制鼻窦组织炎症，减轻成骨及破骨形成，缓解骨质重塑。

Notch信号通路在机体免疫炎症、细胞增殖、分化等生理病理过程中具有重要的调控作用，Notch与其配体DLL1、DLL4等结合，可激活下游炎症信号，引发严重的炎性反应，下调Notch表达可阻止炎症发生发展，破坏成骨和破骨细胞的成熟及功能，抑制骨重建过程[8-9，20]，而miR-155可调控Notch信号的表达。研究[21]发现，在类风湿性关节炎患者体内，miR155与Notch通路相关因子Delta1、Jagged1的表达呈正相关，促进miR-155表达，可上调Notch信号表达，因而预测miR-155可能通过调控Notch通路表达介导炎性反应，进而影响鼻窦炎模型兔的鼻窦骨质重塑。本研究结果显示，Notch信号通路在鼻窦炎模型兔鼻窦组织中处于激活状态，经miR-155 antagomir处理后，兔鼻窦组织Notch-1和DLL4 mRNA及蛋白表达水平降低，表明miR-155可调控Notch信号通路激活，下调miR-155表达可抑制Notch通路相关因子表达，减轻鼻窦炎兔鼻窦骨质重塑，改善其临床症状。

综上所述，miR-155在鼻窦炎兔鼻窦组织中高表达，并促使鼻窦炎病情进展，下调其表达可抑制鼻窦组织炎性反应，减轻鼻窦黏膜损伤，缓解鼻窦骨质重塑，抑制Notch信号通路激活可能是其分子机制之一，但本研究未使用Notch信号通路激动剂和抑制剂做对照验证，后续需进行更全面的研究。