缓释音猬因子的PLGA纳米微球对大鼠脊髓损伤的修复作用

夏 宇，孙 佳，齐争艳，马 琳，牛建国，文玉军

（1.宁夏医科大学基础医学院人体解剖与组织胚胎学系，银川 750004；2.宁夏医科大学颅脑疾病重点实验室，银川 750004）

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是指脊髓受到创伤、炎症、肿瘤或其他原因的损害，导致损伤水平以下运动、感觉或自主神经功能受损[1]。SCI多发于青壮年，目前尚无有效的治疗方法，很多患者瘫痪并伴有膀胱功能障碍、性功能障碍、胃肠道和呼吸问题以及尿路感染等并发症[2]，需要长期康复治疗，给家庭和社会带来了巨大负担。改善SCI后患者的神经功能尤其是运动功能是亟待解决的问题。组织工程技术为SCI的修复提供了一种很有前景的策略[3]。

聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA］由乳酸和羟基乙酸单体共聚而成，是一种可降解的高分子有机化合物，无毒且具有良好的生物相容性，被广泛应用于制药、医用工程材料等领域[4]。作为载体，PLGA是目前应用最广泛的生物材料，用于制造能够缓释药物的递送系统[5]。

音猬因子（sonic hedgehog，Shh）是在果蝇中发现的刺猬分泌蛋白家族的同源物之一[6]。在哺乳动物中，Shh参与了中枢神经系统、眼、四肢、皮肤、肺等多种组织器官的发育，并在神经发生、抗炎、抗氧化、抗凋亡等多种生理过程中发挥作用[7-8]。研究[9]表明，Shh是一种多功能生长因子，在脊髓发育的各阶段均发挥重要作用。本研究以PLGA为载体，包载Shh形成一种缓释纳米微球，将此缓释Shh的纳米微球注射于大鼠SCI部位，观察其对脊髓组织的修复效果和对动物运动功能的改善情况。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雌性SD大鼠36只，体质量230～280 g，由宁夏医科大学实验动物中心提供，质量检测单位为陕西省实验动物质量监督检测中心[许可证号：SCXK（宁）2020-0001］。大鼠在安静环境下饲养，不限制摄食和饮水。本研究经宁夏医科大学医学伦理委员会批准（宁医大伦理第2020-051号）。

1.2 主要试剂及仪器

PLGA、Shh、牛血清白蛋白购自Sigma公司，Nissl染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，兔抗NeuN单克隆抗体（ab177487）购自Abcam公司，ELISA试剂盒购自上海江莱生物科技有限公司，脊髓打击器购自深圳市瑞沃德生命科技有限公司。

1.3 动物分组

将SD大鼠随机分为3个组，每组12只。假手术组（Sham组）：大鼠麻醉后打开T9椎板再逐层缝合；SCI组：打开T9椎板，建立脊髓T9撞击模型；PLGA-Shh组：建立脊髓T9撞击模型后，于损伤部位注射包载Shh的PLGA悬液。

1.4 包载Shh的PLGA纳米微球的制备及释放检测

将0.5 g PLGA溶解于5 mL二氯甲烷中，得到质量体积分数为10%的PLGA溶液；将25μg Shh溶解于2.5 mL牛血清白蛋白（BSA）溶液（50 mg·mL-1）中，将上述溶液混合后用涡旋振荡器振荡使其成乳白色悬液；加入1%聚乙烯醇25 mL，使用超声波细胞粉碎机乳化，得到PLGA乳液；加入0.3%聚乙烯醇溶液200 mL，用保鲜膜封住烧杯口并留孔透气，搅拌12 h，使二氯甲烷充分挥发；将产物离心重悬3次，用冷冻真空干燥仪冻干备用。扫描电镜下观察其形态。取1 mg包封Shh的PLGA微球，溶于100μL磷酸盐缓冲液（PBS）中为1份检测用PLGA-Shh悬液；制备14×6份，用EP管密封置于恒温摇床37℃孵育；每天取6份，离心、取上清液，用EP管密封置于-20℃冰箱内；连续取样14 d后，用Shh的ELISA检测盒，检测其释放量。

1.5 大鼠SCI模型建立及纳米微球注射

大鼠经异氟烷吸入麻醉后，俯卧位固定于手术台上，备皮，消毒，以T11椎体棘突作为定位标志，行背正中切口，切开皮肤，依次分离皮下筋膜、肌肉，暴露T8～T11棘突及椎板，用单关节骨剪咬去T8～T11棘突及T9椎板，充分暴露脊髓，使用脊髓打击器对大鼠脊髓T9节段进行撞击，建立脊髓撞击损伤模型。对于PLGA-Shh组，在损伤部位注射PLGA-Shh悬液。依次缝合肌肉、筋膜和皮肤，消毒后将大鼠置于恒温台等待麻醉苏醒。术后单笼饲养，每天2次予以腹部按摩辅助排尿，直至建立完整的排尿反射。

1.6 大鼠后肢运动功能评价

术后每周对大鼠后肢运动功能进行评价，采用Basso Beattie Bresnahan运动评定量表（BBB评分）和旷场实验。BBB评分前让大鼠在开放环境适应10 min，每次评分至少观察5 min。旷场实验时将大鼠置于100 cm×100 cm的旷场内自由运动5 min，统计其在旷场中的总移动距离。

1.7 脊髓组织灌注取材及染色

术后4周和8周取各组6只大鼠，异氟烷吸入麻醉，依次使用37℃预热的0.9%氯化钠溶液及4℃预冷的4%多聚甲醛溶液灌注，打开椎板取出包含损伤部位在内的脊髓4 cm，在4%多聚甲醛溶液中固定4 h。将脊髓组织转入20%蔗糖PBS溶液中进行脱水。用包埋剂（OCT）包埋，液氮速冻后冰冻切片，切片厚度30μm。

将切片用PBS洗3次，每次5 min，在Nissl染液中浸染15 min，流水冲洗后入分化液分化30 s，上行梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，室温晾干后显微镜下观察拍片。

将切片在磷酸盐曲拉通X-100缓冲液（PBST）中通透3 h；PBS洗后加入内源性过氧化物酶阻断剂，于37℃孵育20 min；PBS洗后滴加5%BSA溶液，于37℃封闭30 min；加入兔抗NeuN单克隆抗体（1∶100），4℃孵育过夜；PBS洗后滴加反应增强液于37℃温箱内孵育20 min；PBS洗后滴加增强酶标山羊抗兔IgG聚合物，37℃孵育1 h；PBS洗后加入新鲜配制的3，3ˊ-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）显色液，室温孵育6 min；自来水冲洗后上行梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，室温晾干后显微镜下观察拍片。

1.8 统计学方法

使用Image J软件分析Nissl染色和免疫组织化学染色的数据，使用Graphpad Prism 8软件进行统计分析并作图。计量资料用均数±标准差（±s）表示，组间比较用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t法。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PLGA-Shh纳米微球形态及释放

在扫描电镜下可见包载Shh的PLGA微球呈圆球形，直径为0.1～0.6μm，表面光滑，大小均一，散在分布（图1A）。ELISA法检测包载Shh的PLGA微球的释放情况，发现14 d内微球持续释放，在前10 d Shh释放浓度维持在2 500 pg·mL-1左右（图1B）。

图1 PLGA-Shh纳米微球形态及释放

2.2 大鼠后肢运动功能恢复情况

所有大鼠术前BBB评分均为满分，术后无意外死亡。除Sham组外，其余大鼠术后1 d均呈截瘫痪状态，后肢运动功能丧失，靠前肢爬行，BBB评分为0分；从术后2周大鼠后肢运动功能开始恢复，PLGA-Shh组大鼠术后第7、8周的评分高于SCI组（P均＜0.05）。旷场实验发现，术后6～8周PLGA-Shh组大鼠运动距离高于SCI组（P均＜0.05），见图2。

图2 术后大鼠后肢运动功能评估

2.3 大鼠SCI情况

大鼠脊髓T9撞击模型制备8周后，Nissl染色显示，受撞击处脊髓内神经元坏死，纤维断裂，组织结构紊乱，坏死区域有瘢痕及空洞形成，见图3。

图3 大鼠脊髓T9撞击损伤（Nissl染色，bar=1 mm）

2.4 SCI区吻侧和尾侧灰质前角运动神经元（motor neurons，MNs）的变化

术后4周、8周，对SCI区吻侧和尾侧6～8 mm处的脊髓断面进行Nissl染色发现，与Sham组相比，SCI组和PLGA-Shh组大鼠SCI区吻侧和尾侧脊髓灰质前角MNs均不同程度地减少。术后8周，PLGA-Shh组大鼠SCI区吻侧和尾侧脊髓灰质前角MNs均高于SCI组（P均＜0.05），见图4。

图4 SCI区吻侧和尾侧灰质前角MNs的变化

2.5 SCI区吻侧和尾侧灰质前角NeuN表达情况

术后4周、8周，对SCI区吻侧和尾侧6～8 mm处的脊髓断面进行NeuN免疫组织化学染色并统计NeuN阳性细胞与灰质前角面积占比，发现与Sham组相比，SCI组和PLGA-Shh组大鼠SCI区吻侧和尾侧灰质前角NeuN阳性细胞占比均不同程度地减少（P均＜0.05）；术后8周，PLGAShh组大鼠SCI区吻侧和尾侧灰质前角NeuN阳性细胞占比均高于SCI组（P＜均0.05），见图5。

图5 SCI区吻侧和尾侧灰质前角NeuN表达情况

3 讨论

本研究以PLGA为载体，包载Shh形成一种缓释纳米微球，将其用于大鼠SCI区，发现可提高损伤区周围脊髓灰质内神经元数量，并改善大鼠后肢的运动功能。

SCI严重危害患者的生活质量，目前的治疗方法主要集中在对症治疗、康复治疗以及对并发症的治疗上[10]，亟待开发能够促进脊髓再生进而改善患者神经功能的新疗法。纳米材料的发展为SCI修复提供了具有前景的新手段[3]。本研究采用油水乳液挥发有机溶剂法[11]将Shh包埋在可生物降解的PLGA纳米微球中，实验结果表明PLGAShh纳米微球能够持续稳定地释放Shh，将此缓释微球注射于SCI区，该药物系统能够在SCI区局部、缓慢、持续地释放治疗药物。Shh是一种具有多种功能的生长因子，对中枢神经系统发育中神经元的形成、轴突生长、增殖、存活和分化至关重要[12]，尤其对脊髓MNs的分化、成熟、髓鞘及突触形成起着重要作用，是SCI修复的理想选择[13]。

在我国，造成SCI的原因主要是交通意外所致的外伤。本实验采用脊髓撞击损伤模型[14]，撞击后可见脊髓局部形成血肿，损伤处神经元坏死、神经纤维断裂，组织结构紊乱，有瘢痕及空洞形成。脊髓撞击模型相较于脊髓横断、脊髓半切等模型更能够模拟临床病患的实际情况，更具有代表性[15]。

本研究发现，PLGA-Shh微球治疗7周、8周后大鼠的BBB评分和在旷场中的运动距离均高于SCI组，在术后护理中也发现PLGA-Shh组大鼠比SCI组大鼠恢复自主排尿时间更短，表明PLGA-Shh微球治疗能促进大鼠SCI后肢的运动功能恢复以及膀胱排尿反射的建立。尼氏小体对病理刺激非常敏感，通常被认为是神经细胞损伤的良好指标，NeuN是一种神经元特异性核标记蛋白[16]。Nissl染色和NeuN表达结果显示，术后8周PLGA-Shh组SCI区吻侧和尾侧灰质前角MNs数量均高于SCI组，表明PLGA-Shh缓释微球能够持续发挥作用，促进损伤区周边MNs的存活[17]。最新研究[18]发现，脊髓撞击伤后动物后肢运动功能的恢复与残存的下行脊髓固有束（descending propriospinal tract，dPST）密切相关，这些dPST与腰髓灰质MNs形成突触连接，传导来自损伤区吻侧下行皮质脊髓束、皮质红核束的神经冲动，从而控制后肢的随意运动。本研究中大鼠后肢运动功能的恢复可能与投递到损伤区的Shh促进MNs的存活并进而增加了dPST与腰髓灰质MNs的突触连接有关。

综上所述，本研究成功制备了一种可缓释Shh的PLGA纳米微球，将其注射于大鼠SCI区后，PLGA-Shh持续释放，促进了损伤区周边灰质MNs的存活，并有效改善了大鼠后肢的运动功能。PLGA-Shh缓释纳米微球为SCI修复提供了一种新疗法，有望进一步向临床应用转化。