环状RNA在骨质疏松症中的研究进展

曹年平 陈波波 黄崇峻 徐莹 田野*

1. 中国医科大学附属盛京医院骨科，辽宁 沈阳 110004 2. 中国医科大学附属盛京医院麻醉科，辽宁 沈阳 110004

骨质疏松症(osteoporosis，OP)好发于老年人、绝经后女性和糖皮质激素用药者，因其致骨折风险增高，严重影响人们的生活质量。然而目前仍没有特效治疗能逆转OP骨质丢失，亟需研究OP发生机制并开发更有效的治疗方法。最新研究发现环状RNA有望成为OP的诊断标志物和治疗新途径。环状RNA(circRNAs)是由反向剪接形成的无5’末端帽子和3’末端poly(A)尾的共价闭合环状结构的非编码RNA[1]。已知circRNAs可作为miRNAs和蛋白质的海绵，抑制miRNAs和蛋白质功能；circRNAs还可以调控转录以及部分翻译为蛋白质或作为蛋白质支架发挥作用[2]。近年来大量研究表明circRNAs在心血管系统疾病、神经系统疾病和骨科疾病[3-7]等中起重要作用。本文将对circRNAs在多种类型OP中发挥的调控作用和诊断价值进行综述。

1 CircRNAs调控绝经后骨质疏松症

绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是由于绝经后女性雌激素水平下降，成骨-破骨活动偏向于骨吸收而形成的骨代谢性疾病。CircRNAs在PMOP中存在差异表达。外周血单核细胞RNA测序结果显示，PMOP患者有73个circRNAs显著上调和300个circRNAs显著下调[8]。一些circRNAs可调节BMP-2表达。BMP-2属于转化生长因子β超家族蛋白，可诱导干细胞成骨分化。PMOP患者中circ_0016624和circ_0048211均显著降低，两者过表达时均使BMP-2表达升高。经靶点预测和双荧光素酶报告基因实验得出circ_0016624海绵抑制miR-98以及circ_0048211海绵抑制miRNA-93-5p，从而提高了BMP-2表达，并促进干细胞向成骨细胞转化[9-10]。由此可见，促BMP-2表达的circRNAs生成减少是PMOP发生机制之一。此外，circ_0001795[11]在PMOP患者骨组织中表达降低。骨髓基质细胞过表达circ_0001795后破骨分化受抑制，其机制是circ_0001795抑制miR-378作用而提高BMP-2表达，这可能对抑制PMOP进展具有重要作用。

外泌体是细胞分泌的含有信息交流物质的小囊泡。PMOP患者骨髓间充质干细胞(BMSCs)分离的外泌体行微阵列测序，发现237个上调和279个下调的 circRNAs[12]。Zhi等[13]发现PMOP患者血清分离的外泌体中circ_0006859显著升高，体外实验证实circ_0006859通过海绵miR-431-5p上调ROCK1表达来抑制骨生成并促进脂肪生成。因此，circRNAs可能以外泌体形式作用于成骨细胞和破骨细胞，对骨微环境发挥调节作用。

2 CircRNAs调控老年性骨质疏松症

老年性骨质疏松症(senile osteoporosis，SOP)是与衰老有关的原发性骨质疏松症，骨髓间充质干细胞老化和成骨能力下降是其重要的发病机制[14]。最新研究[15-16]表示SOP与circRNAs的表达调控有关。对老年男性骨质疏松性椎体压缩骨折患者的外周血RNA测序，发现884个差异表达的 circRNAs(554个上调，330个下调)[15]。KEGG分析显示差异表达的circRNAs功能主要与“RNA转运、MAPK信号通路、TP53转录调控”等通路有关。另一项研究[16]对老年男性骨质疏松患者的BMSCs行RNA测序，筛选出circ_0006215显著降低。过表达circ_0006215能促进BMSCs成骨分化，其机制是circ_0006215作为miR-942-5p海绵而促进成骨因子RUNX2和血管内皮生长因子VEGF表达。并且过表达circ_0006215的BMSCs培养上清液可促进人脐静脉内皮细胞迁移和血管生成。因此，circ_0006215具有促进骨生成和血管生成的潜力，其表达降低可能是SOP形成的重要原因。

3 CircRNAs调控激素性骨质疏松症

糖皮质激素(glucocorticoid，GC)作为抗炎和免疫抑制剂被广泛应用，但长期GC治疗可导致糖皮质激素性骨质疏松症(glucocorticoid-induced osteoporosis，GIO)。研究[17]表明GC可抑制成骨细胞生成，促进骨细胞凋亡，同时延长破骨细胞的寿命。有报道[18]miRNAs参与GIO形成，如Let-7f-5p可调节TGFBR1表达，改善GIO骨量丢失，而circRNAs具有miRNAs海绵等功能也能调控GIO的发生发展。

Wang等[19]发现circRNAs在GIO中具有促进骨生成的作用。Wang等在细胞和动物模型中过表达circ_0006393能上调成骨基因的表达和提高GIO模型小鼠的骨密度。深入研究发现，circ_0006393海绵结合miR-145-5p而上调FOXO1表达。FOXO1是抑制成骨细胞氧化损伤的关键蛋白，具有促进成骨的作用[20]。地塞米松抑制成骨细胞生长并促进其凋亡，如何解决这个问题是治疗GIO的关键。研究[21]发现，敲除circ_0001275后可改善地塞米松对成骨细胞生长的不利影响，其可能机制是敲除circ_0001275后，miR-377/CDKN1B 轴被激活从而逆转GC对成骨细胞生长的抑制。

许多研究[18,22]表示miRNAs在GIO中具有调控作用。CircRNAs作为miRNAs调节分子，能否通过广泛影响miRNAs作用而调控GIO发生发展，有待进一步研究。总之，以上三种类型OP中均有circRNAs表达改变并通过miRNAs海绵发挥调控作用，见表1。

表1 3种类型骨质疏松症中circRNAs的调控作用及机制Table 1 The regulatory role of circRNAs in three types of osteoporosis

4 CircRNAs对骨内细胞的调控作用

4.1 CircRNAs对干细胞的调控

多种干细胞具有成骨分化潜能，包括骨髓间充质干细胞(BMSCs)、脂肪干细胞(ASCs)和牙髓干细胞(DPSCs)等。研究表明circRNAs能促进干细胞成骨分化。Yang等[23]发现circ-VANGL1能海绵抑制miR-217而提高RUNX2表达。RUNX2是成骨分化转录因子，已证实在ASCs等干细胞成骨分化中起重要作用[24]。基于RUNX2改善骨质疏松症作用，研究其上游机制发现circRUNX2和circ_0011269也能促进RUNX2表达[25-26]，并通过circRUNX2/miR-203/RUNX2和circ_0011269/miR-122/RUNX2通路促进BMSCs成骨分化。

现有研究大多关于circRNAs在BMSCs中的作用，但circRNAs也调控其他干细胞。Ji等[27]在牙髓干细胞(DPSCs)中发现circ_0026827能海绵结合miR-188-3p，上调自噬促进因子Beclin1和成骨促进因子RUNX1表达，促进DPSCs成骨分化。Shen等[28]发现circFOXP1在OP患者中显著下调，并且circFOXP1可以作用于miR-33a-5p而上调FOXP1表达，促进ASCs成骨分化，同时在老鼠模型中过表达circFOXP1能促进ASCs异位成骨，表明circFOXP1具有促进骨生成和预防骨质疏松的潜在作用。

CircRNAs对干细胞成骨分化有积极作用，然而circRNAs也可能促进骨质疏松。Lin等[29]发现去卵巢小鼠模型中circ-SLC8A1高表达并通过海绵结合miR-516b-5p，使A激酶锚定蛋白2上调，从而促进骨质疏松症进展。研究[30]表示低强度激光照射可提高BMSCs增殖能力，因其下调circ_0001052，升高miR-124-3p水平，激活促增殖的Wnt/β-catenin通路。还有褪黑素能降低circ_0003865表达而促进BMSCs成骨分化[31]。因此，一些circRNAs可能对BMSC增殖和成骨分化存在负性作用。

4.2 CircRNAs对成骨细胞的调控

CircRNAs能调节前成骨细胞增殖和凋亡。研究[32]发现过表达circRNA AFF4促进前成骨细胞MC3T3-E1增殖和抑制其凋亡。其中circRNA AFF4通过海绵结合miR-7223-5P使PIK3R1升高而促进MC3T3-E1增殖。还有研究[33]从鼠BMSCs中分离出含有circ-Rtn4的外泌体(Rtn4-Exos)与MC3T3-E1共培养后可减轻TNF-α对MC3T3-E1的细胞毒和细胞凋亡，提示Rtn4-Exos是成骨细胞的保护因子。除了影响前成骨细胞增殖和凋亡，circRNAs还能调节前成骨细胞的成骨分化和骨矿化。Circ_003795[34]在MC3T3-E1和MDPC-23细胞(小鼠成牙本质细胞)成骨分化中显著升高。研究得出circ_003795可以作用于miR-1249-5p，并上调COL15A1表达，促进MC3T3-E1和MDPC-23细胞成骨分化及矿化。

4.3 CircRNAs对破骨细胞的调控

骨髓单核/巨噬细胞(bone marrow monocyte/macrophage cells，BMMCs)是破骨细胞的前体，破骨细胞大量生成使骨吸收增加，引起骨质疏松。研究表明circRNAs能促进破骨细胞生成。Chen等[35]在诱导BMMCs破骨分化时发现circRNA_28313显著上调，并且circRNA_28313可以解除miR-195a对促破骨分化进基因CSF1的抑制，从而促进破骨细胞分化。Miao等[36]发现成熟破骨细胞中circRNA_009934升高明显，过表达circRNA_009934促进BMMCs增殖和破骨分化，而抑制circRNA_009934时，破骨细胞生成减少，因为circRNA_009934可海绵结合miR-5107，上调促破骨分化基因TRAF6表达，从而促进BMMCs增殖和破骨细胞生成。

肿瘤坏死因子-α(TNF-α)能促进破骨分化并抑制成骨分化[37]。研究发现TNF-α诱导破骨细胞分化时，circHmbox1表达降低，并通过影响下游miR-1247-5p和Bcl6 表达促进破骨细胞生成。TNF-α促进破骨细胞分泌含circHmbox1的外泌体，此外泌体与前成骨细胞共培养时，可抑制成骨分化。因此，circHmbox1是TNF-α诱导破骨分化和抑制成骨分化的重要调节因子[38]。以上circRNAs在骨内细胞中的调控作用和海绵机制靶点见表2。

表2 骨内细胞中circRNAs的调控作用及机制Table 2 The regulatory role of circRNAs in bone cells

5 CircRNAs在骨质疏松症中的通路研究

成骨分化和矿化是骨生成的关键途径，许多信号通路参与其中，包括Notch[39]、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)[40]、Wnt/β-catenin[41]等信号通路。研究表明许多circRNAs能调节信号通路基因促进成骨分化。Huang等[41]发现BMSCs和MC3T3-E1成骨分化过程中YAP1升高。有报道[42]YAP1能激活Wnt/β-catenin通路促进成骨。探究YAP1上游机制发现，circ_0024097可解除miR-376b-3p对YAP1的抑制，促进YAP1表达[41]。因此circ_0024097通过Wnt/β-catenin通路促进BMSCs和MC3T3-E1的成骨分化。此外，研究[40]发现circRNA CDR1as通过miR-7/GDF5轴，激活Smad1/5/8和p38 MAPK通路，促进牙周膜干细胞的成骨分化。可见circRNAs可能调控多种信号通路，影响OP的发展。

6 CircRNAs作为骨质疏松症诊断和预后生物标志物

骨质疏松症(OP)诊断的金标准是测量骨密度计算T值。若T值低于-2.5，即诊断为OP[43]。临床上外周静脉血便于获取，而circRNAs有较稳定的环状结构，可能成为新的OP诊断和预后标志物。Xiang等[44]分别检测健康人、骨量减少人、OP患者血浆，发现OP患者血浆中circ_0001445显著降低。皮尔逊相关分析示circ_0001445与T值呈正相关，与反映骨吸收的β-CTx呈负相关；ROC曲线示circ_0001445对诊断OP的灵敏度和特异性分别为97.62 %和82.22 %。OP患者治疗6个月后，circ_0001445水平上调。因此，综合分析circ_0001445可作为OP诊断和判断预后标志物。

研究发现一些circRNAs上调可能提示OP的发生。PMOP患者外周血单核细胞中检测到circ_0001275显著升高[45]。ROC曲线示circ_0001275对PMOP患者有诊断价值。从58例PMOP患者和60例健康人血清分离的外泌体中发现，PMOP组circ_0006859显著升高。经分析circ_0006859以ROC曲线下面积0.897 4，93.1 %的高灵敏度和93.33 %的高特异性可用于诊断PMOP[13]。虽然circRNAs在临床疾病诊断中未广泛应用，但circRNAs较线性RNA稳定，随着circRNAs相关研究不断深入，其临床应用前景将会逐渐体现。

7 总结与展望

CircRNAs可调控干细胞成骨分化和单核巨噬细胞破骨分化影响骨质疏松症进展，还能调节多种成骨信号通路并作为骨质疏松症生物标志物。然而，近年来circRNAs虽在许多疾病中广泛研究，但在骨质疏松症中研究还处于起步阶段，且主要集中于研究circRNAs的miRNAs海绵机制。CircRNAs能否调控更多成骨信号通路以及circRNAs作为蛋白质支架和调控转录等其他机制是否存在骨质疏松症中有待进一步研究。骨质疏松症是亟需解决的健康问题，circRNAs的深入研究有望对其病因、诊断、治疗和预后提供新的见解和解决方案。