微生物菌剂对秸秆降解及秸秆中微生物变化规律的影响

孙翠焕, 陈丽媛, 陈 杰, 郭玲玲, 敖 静, 王志学

(辽宁省微生物科学研究院,辽宁 朝阳 122000)

秸秆是一种天然的农业可再生资源和理想的肥料资源[1]。有数据显示,100 g秸秆中含碳44.2 g、氮0.62 g、磷(五氧化二磷)0.25 g、钾(氧化钾)1.44 g,以及钙、镁、硫、硅、铁、锌、锰、钼等中、微量元素[2]。我国农作物秸秆每年产量约7亿t,其中玉米秸秆占30%左右[3-4],东北地区是我国重要的粮食主产区,每年产生的玉米秸秆总量达1.7亿t,秸秆资源十分丰富[5]。秸秆还田是将秸秆直接或间接还田的一种处理方法[6],是一种强化土壤有机质积累、调节土壤温度和水分的方式[7]。秸秆还田技术的合理利用可缓解土壤质量下降及秸秆资源浪费的情况[8],可以增加土壤有机碳含量,提升土壤肥力[9],同时也是在目前全球变暖条件下,如何利用土壤碳截流减缓温室效应所追求的目标[10]。秸秆还田对提高氮素有效性有促进作用[11],有研究显示土壤微生物量碳氮均呈现明显增加趋势,表明土壤中的微生态环境得到了很大改善[12]。张旸等[13]研究发现,秸秆还田增加了土壤中碳氮磷钾的积累量。李辛等[7]研究发现秸秆还田能显著提高土壤有机质、速效磷、速效钾的含量,同时还增加了5～15 cm土层的土壤容重,降低了15～25 cm土层的土壤容重。秸秆还田可影响土壤结构,改善土壤微生态[14],增加土壤微生物代谢和多样性[15]。同时,深层土壤在连续秸秆浅耕还田后,明显改善了土壤透气性,并有效降低了土壤容重[16]。秸秆降解所用的腐解菌剂是一类能够产生纤维素酶、半纤维素酶和木质素酶等的微生物菌剂[17]。由于农作物秸秆主要由纤维素、半纤维素和木质素组成,自然状态下难以被微生物分解。添加微生物菌剂可以加快秸秆的腐解,秸秆还田既可充分利用秸秆资源为农田提供大量优质有机肥料,同时可减轻秸秆焚烧造成的生态环境污染,是发展有机可持续农业的有效途径[18-19]。秸秆原位直接还田是目前我国采用的主要还田方式,该方式存在秸秆腐解较慢、对土壤营养成分提升不明显等问题[20]。秸秆还田配合使用腐解菌剂可以促进秸秆腐解,使土壤养分增加[21-22]。李祥等[23]采用秸秆+尿素+自制微生物菌剂+土壤调理剂的模式还田,还田10个月,小麦秸秆腐解率达100%,有效改善了土壤结构,并使土壤有机质含量增加。范作伟等[17]在秸秆浅旋和旋耕还田方式下,施用腐解菌剂处理的秸秆腐解率显著高于未施用菌剂的处理。冯敏等[24]研究表明,秸秆还田能有效增加土壤中氨化细菌、硝化细菌和固氮菌的数量并使其活性增强,进而提高土壤氨化活性和硝化活性,而相关菌群数量的变化与土壤氨化活性和硝化活性呈正相关。杨冬静等[25]研究发现,水稻秸秆还田可提高土壤中细菌多样性,小麦秸秆还田可提高土壤真菌多样性,其他还田方式也对土壤微生物的多样性有一定程度的影响,说明稻麦秸秆还田改变了土壤微生物群落结构以及微生物菌群的相对丰度。此外,Yu等研究发现,秸秆还田可提高土壤微生物的数量和活性[26],土壤微生物数量和活性的提高对秸秆的腐解又起到促进作用[27],表明秸秆还田与土壤微生物之间是相互促进相互影响的。为明确不同微生物菌剂在秸秆降解中的作用及对秸秆中微生物菌群数量的影响,本研究在温室大棚内进行不同菌剂对秸秆降解率影响试验,并研究秸秆中可培养真菌、细菌、放线菌数量的动态变化,以期为微生物菌剂在秸秆还田中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试材料 地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)由辽宁省微生物菌种保藏中心提供。玉米秸秆(喀左天盛农业科技有限公司提供)风干,去除叶片,切段(长10～15 cm),105 ℃烘箱烘干至恒重备用。60目尼龙滤布(购自化试商店)剪成50 cm×50 cm方块备用。

1.1.2 试验区 试验时间为2020年10月至2021年4月,试验地点为辽宁省喀左天盛农业科技有限公司生产基地温室大棚。

1.1.3 培养基 ①NA培养基:用于培养细菌;②PDA培养基:用于培养真菌;③改良高氏一号培养基:用于培养放线菌。固体培养基添加2%琼脂。

1.1.4 主要试剂与仪器设备 生理盐水(称取氯化钠4.5 g,加入蒸馏水500 mL,充分搅拌溶解,121 ℃灭菌20 min,备用)。氯化钠、牛肉浸膏、蛋白胨、葡萄糖等试剂均为分析纯。高压灭菌锅(LDZX-50KBS,上海申安医疗器械厂);恒温培养箱(SPX-450,中仪国科(北京)科技有限公司);烘箱(XMTD-8222,上海精宏实验设备有限公司);电子天平(JA2003,上海天平仪器厂);全温振荡器(HZQ-Q,东联电子技术开发有限公司) 。

1.2 方法

1.2.1 微生物菌剂制备 ①菌种活化:在保藏试管中挑取地衣芽胞杆菌菌体于NA试管培养基上划线,35 ℃避光培养3 d。挑取哈茨木霉菌丝于PDA试管培养基上划线,28 ℃避光培养至表面全部变绿。②菌剂制备:挑取活化好的地衣芽胞杆菌至NA液体培养基,35 ℃、180 r/min培养12 h,活菌数约为0.5×108cfu/mL,备用;哈茨木霉试管中加无菌生理盐水,制成菌悬液,涂布于PDA平板,28 ℃避光培养至表面全部变绿,用无菌生理盐水将孢子刮下,制成孢子悬液,活菌数调至0.5×108cfu/mL。

1.2.2 试验设计 试验设3个处理。对照组:玉米秸秆;处理1:玉米秸秆+哈茨木霉;处理2:玉米秸秆+哈茨木霉+地衣芽胞杆菌。用修枝剪刀将玉米秸秆剪成长10～15 cm秸秆段,用剪好的尼龙滤布包裹秸秆段,每袋100 g,共计27袋。挖9个长50 cm、宽50 cm、深30 cm的土坑。每个处理设3个平行土坑,每个土坑放置3袋秸秆为3个平行样。秸秆中分别按0.2%(体积分数)的接种量加入无菌水、哈茨木霉、哈茨木霉+地衣芽胞杆菌,覆土厚20 cm并压实,浇水并保持土壤水润,每隔30 d,3个处理各取1个土坑的秸秆(3袋同时取出),进行相关指标测定。

1.2.3 秸秆降解率测定 取出各处理秸秆,称量鲜重,然后用自来水冲洗,去掉泥土及被分解成粉状的腐殖质,105 ℃烘干至恒重,称量干重,计算降解率。计算公式:降解率(%)=((100-干重)/100)×100%。

1.2.4 活菌数测定 活菌数采用稀释平板法测定。①可培养细菌活菌数测定:取出各处理秸秆,称取湿重5.0 g,用无菌剪刀剪碎(0.5 mm×0.5 mm),置于装有95.0 mL无菌生理盐水的带有玻璃珠的250 mL无菌锥形瓶中,置振荡器中160 r/min振摇30 min,充分混匀后,取上清液1 mL,加无菌生理盐水9 mL,制成10倍稀释液,之后按10倍梯度关系稀释,分别取10-3、10-4、10-5、10-6稀释倍液0.1 mL涂平板,平行制备3个平板,30 ℃倒置培养48 h,进行菌落计数。②可培养真菌活菌数测定:样品处理同①,分别取10-2、 10-3、10-4、10-5稀释倍液0.1 mL涂平板,平行制备3个平板,28 ℃倒置培养3 d,进行菌落计数。③可培养放线菌活菌数测定:样品处理同①,分别取10-2、 10-3、10-4、10-5稀释倍液0.1 mL涂平板,平行制备3个平板,28 ℃倒置培养3 d,进行菌落计数。

2 结果与分析

2.1 不同微生物菌剂处理对秸秆降解率的影响

从图1可以看出,不同处理对秸秆降解率有很大差异,在降解试验设置时间内,处理1的秸秆降解率明显高于对照组和处理2,对照组的秸秆降解率始终高于处理2,表明单独添加哈茨木霉菌剂处理秸秆,其降解率高于不添加菌剂和添加哈茨木霉+地衣芽胞杆菌混合菌剂。添加哈茨木霉+地衣芽胞杆菌混合菌剂,其降解率低于不添加任何菌剂的对照组。

图1 不同微生物菌剂处理对秸秆降解率的影响Fig.1 The effect of different microbial agents on the degradation rate of straw

2.2 不同微生物菌剂处理、不同降解时段对秸秆降解率的影响

从图2可以看出,处理1与对照组相比,在0～30 d和30～60 d时段,处理1的秸秆降解率明显高于对照组,从第60天开始,处理1的降解率始终低于对照组,但是总降解率始终是处理1高于对照组;处理2与对照组相比,在0～30 d,处理2的降解率明显低于对照组,但30～60 d出现一个降解高峰,之后处理2的降解率始终低于对照组,但总降解率对照组高于处理2;处理1与处理2相比,在0～30 d和30～60 d时段,处理1的秸秆降解率明显高于处理2,之后的降解率没有明显规律,相互有高有低,但总降解率始终是处理1高于处理2。

图2 不同微生物菌剂处理、不同降解时段对秸秆降解率的影响Fig.2 The effect of different microbial agent treatments and different degradation periods on the degradation rate of straw

2.3 不同微生物菌剂处理对秸秆中可培养细菌数量的影响

从图3可以看出,处理1在0～30 d时可培养细菌数增加迅速,第120天时达到峰值为2.00×109cfu/g,之后缓慢下降;从处理1的整个试验时段来看,可培养细菌数增加和下降速度较缓慢,在第180天时,可培养细菌数仍为1.02×109cfu/g。

图3 不同微生物菌剂处理对秸秆中可培养细菌数量的影响Fig.3 The effect of different microbial agent treatments on the quantity of cultivatable bacteria in straw

对照组和处理2可培养细菌数在0～120 d时一直呈上升趋势,第120天时达到峰值,分别为3.92×109cfu/g和3.10×109cfu/g,可培养细菌数明显高于处理1,之后迅速下降,在第180天时,可培养细菌数已分别下降至0.58×109cfu/g和0.48×109cfu/g,可培养细菌数均低于处理1。

相关性分析表明,在前30 d,秸秆降解率与可培养细菌数呈正相关,相关系数达到0.935 4。第30天后,秸秆的降解率受其他因素影响较大,与秸秆中细菌数量不相关。

2.4 不同微生物菌剂处理对秸秆中可培养真菌数量的影响

从图4可以看出,处理1秸秆中可培养真菌数在0～30 d快速增加,在第90天达到峰值为1.9×107cfu/g,之后快速下降;对照组和处理2在0～60 d时,可培养真菌数增加缓慢,之后快速增加,分别在第90天和120天时达到峰值,为1.14×107cfu/g和1.54×107cfu/g,然后缓慢下降。对照组和处理1比处理2的真菌数最高点出现早30 d;处理1和处理2的可培养真菌数在0～120 d均高于对照组。

图4 不同微生物菌剂处理对秸秆中可培养真菌数量的影响Fig.4 The effect of different microbial agent treatments on the quantity of cultivatable fungi in straw

相关性分析表明,前30 d秸秆降解率与秸秆中可培养真菌数高度相关,相关系数为0.870 5;30～90 d则有很小相关性;第30天后,秸秆降解与秸秆中可培养真菌数不相关。

2.5 不同微生物菌剂处理对秸秆中可培养放线菌数量的影响

从图5可以看出,在试验时段的前30 d,放线菌数量快速增加,处理1增加数量明显高于对照组和处理2;在90～120 d时,三个处理都未能检测到放线菌,在150～180 d时,三个处理的放线菌数量均同时大量出现,之后对照组和处理1均快速下降,只有处理2呈上升趋势。分析三个处理的秸秆中90～120 d均未能检测到放线菌,可能是真菌、细菌大量增加抑制了放线菌的生长所致。

图5 不同微生物菌剂处理对秸秆中可培养放线菌数量的影响Fig.5 The effect of different microbial agent treatments on the quantity of cultivatable actinomyces in straw

相关性分析表明,前30 d秸秆降解率与秸秆中可培养放线菌数高度相关,相关系数为0.924 5;30 d后,秸秆降解与秸秆中可培养放线菌数不相关。

3 讨 论

本研究发现,不同微生物菌剂对秸秆降解作用不同,单独添加哈茨木霉菌剂处理秸秆能显著提高秸秆降解率,前期作用尤其明显;添加哈茨木霉+地衣芽胞杆菌混合菌剂降低了秸秆降解率,前期尤其显著。由于土壤和秸秆中携带具有降解秸秆功能的菌群,可能添加的地衣芽胞杆菌与其他秸秆降解微生物竞争养分,抑制了哈茨木霉和其他具有降解秸秆功能的微生物生长。国内外研究表明芽胞杆菌有促进植物生长的作用[28-31],但可能对秸秆降解作用不明显。

不同处理对秸秆中可培养真菌、细菌、放线菌数量的影响显著不同。秸秆上生长的各种微生物分泌的酶类对秸秆降解起重要作用,相关性分析表明,在秸秆降解的前30 d,秸秆降解率与秸秆中生长的可培养真菌、细菌、放线菌数量呈显著正相关。在秸秆分解的其他时间段,秸秆降解率与秸秆中可培养微生物相关性小,可能在秸秆降解的中后期,秸秆降解率与秸秆中不可培养微生物、土壤动物等大量出现有关。

不同微生物菌剂对秸秆中微生物数量变化影响显著,接种哈茨木霉处理的秸秆中真菌、细菌、放线菌数在前30 d明显高于对照和哈茨木霉+地衣芽胞杆菌混合菌剂处理,差异显著;可培养细菌数均在120 d左右达到峰值,但是对照组和哈茨木霉+地衣芽胞杆菌混合菌剂处理的可培养细菌总数明显高于哈茨木霉处理;哈茨木霉处理和对照组的可培养真菌总数峰值出现在第90天,哈茨木霉+地衣芽胞杆菌混合菌剂处理在第120 天达到峰值,并且哈茨木霉处理和对照组的真菌总数峰值明显比哈茨木霉+地衣芽胞杆菌混合菌剂处理的峰值高;在秸秆降解30 d后,三个处理的秸秆中都未能检测到放线菌,说明菌数未处于检测范围,可能与真菌、细菌数量大量增加后,抑制了放线菌的生长所致。刘佳斌等[32]研究表明,在秸秆还田条件下,玉米抽雄期土壤放线菌数量明显低于其他生长期,放线菌数量与植物生长期也有关。秸秆降解后期,对照组和哈茨木霉处理的秸秆中放线菌数量均大幅度下降,哈茨木霉+地衣芽胞杆菌混合菌剂处理的秸秆中放线菌数量仍呈上升趋势,而木霉有防治植物病害作用[33],后期的抑制病害作用可能与放线菌数量的增加有一定关系。