电针通过Parkin 介导的线粒体自噬途径改善脑缺血再灌注损伤的机制研究

★ 陈阿贞 兰岚 谢小文 高丽丽（福建中医药大学附属第二人民医院 福州 350003）

缺血性脑血管病严重危害人类的健康，有发病率高、死亡率高、致残率高等特点［1-2］。在超早期通过溶栓治疗等方式恢复缺血脑组织灌注已被证实是有效治疗方法之一，但有研究提示，脑缺血再灌注是加重脑功能损伤的关键病理环节，因为再灌注过程中，缺血脑组织可能会因炎症反应或活性氧积累等而进一步加重，使得缺血性脑卒中治疗及预后不佳［3］。针灸作为传统的治疗方法，已广泛应用于脑血管疾病的治疗，并在临床康复中有良好的治疗效果，但其作用机制尚未清楚。本课题前期研究表明，电针曲池、足三里可改善脑缺血再灌注损伤大鼠的运动及认知等功能障碍［4-6］，但其具体作用机制仍需进一步阐明。

近年来研究表明，脑缺血再灌注损伤可使线粒体自噬活化，线粒体自噬的激活能进一步减轻脑缺血再灌注损伤，故线粒体自噬成为干预脑缺血再灌注损伤的重要潜在靶点［7］。已有大量研究表明，PINK1/Parkin 参与了脑缺血再灌注损伤的病理过程，且上调线粒体自噬水平具有保护神经细胞的作用［8-9］。因此，Parkin 介导的线粒体自噬途径显得尤为重要。本课题组前期研究证明了电针在脑缺血再灌注损伤中的多靶点作用，基于线粒体自噬在脑缺血再灌注中的作用，本课题以大脑中动脉缺血（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠为模型，进一步从Parkin 介导的线粒体自噬途径揭示电针治疗脑缺血再灌注损伤的机制，为临床电针治疗脑缺血性疾病提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

本次实验选用45 只SPF 级健康雄性SD 大鼠，体重为（250±50）g，动物饲养于福建中医药大学SPF 级动物实验中心，恒温恒湿，模拟12 h/12 h 昼夜循环光照系统，予以自由饮食及饮水。福建中医药大学动物实验中心动物饲养环境许可证：SYXK（闽）2021-0007。用随机数字法随机选取15 只为假手术组，造模成功后的模型大鼠再随机分为模型组及电针组，各15 只。

1.2 主要材料及仪器

PINK1、Parkin、β-actin 抗体均购于美国Cell Signaling Technology 公司；TUNEL 试剂盒、增强型RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂、BCA蛋白定量试剂盒、Tris-Glycine-SDS 电泳缓冲液等购于博士德；华佗牌电针仪（型号SDZ-Ⅱ）购于苏州医疗用品厂有限公司；超净工作台（Opticlean-1300）购于力康生物医疗公司；病理切片机（型号RM2016）购于上海徕卡仪器；Gel DOC 2000 凝胶成像系统、电热恒温水槽（型号DK-8AD）均购于上海一恒；琼脂糖水平电泳仪购于北京六一生物科技有限公司；凝胶玻璃板、固定夹及转移槽购于美国Bio-Rad公司；HE 成像仪（型号Nikon DS-U3）及超微量紫外可见分光光度计均购于杭州米欧仪器有限公司 ；Image-Pro-Plus 图像分析系统购于美国Media Cybernetics 公司。

1.3 MCAO 大鼠模型建立

参照Longa 等［10］改良线栓法规范化制备大鼠MCAO 模型。称重，按0.35 mL/kg 腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，从颈正中纵行切开皮肤以暴露左侧颈总动脉（CCA），分离颈外动脉（ECA）、颈内动脉（ICA）颅外段，并在根部结扎ECA，动脉夹夹闭ICA，在CCA 分叉下方约3 mm 处剪一“V”型小口，缓慢插入头端圆钝、直径约0.25 mm 的尼龙线栓，线栓经CCA 分叉处进入ICA，当有少许阻力时停止插入，松开动脉夹，此时线栓头端距离分叉处约18 mm，表示线栓头端已到达大脑中动脉起始端，固定线栓，待缺血90 min 后，撤出线栓以恢复血流再灌注。实验过程及动物苏醒期间使用37 ℃恒温台进行保温。待大鼠完全清醒后，采用Zea Longa 法［10］进行神经功能评分，1～3 分者为造模成功，所有造模成功的模型大鼠再按随机数字法分为模型组及电针组2 组；假手术组大鼠麻醉后只暴露、分离血管后缝合皮肤。动物处理方法经福建中医药大学医学伦理委员会审定，按照中华人民共和国科技部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》执行。

1.4 干预措施

（1）电针组：电针组于MCAO 术后24 h 开始电针治疗，干预方法参照中国针灸学会实验针灸委员会制定的实验动物穴位图谱，选取大鼠右侧曲池、足三里穴（大鼠穴位定位参考《实验针灸学》［11］中的定位方法）为电针穴位，选用30 号0.5 寸华佗牌不锈钢毫针刺入，应用SDZ-Ⅱ电针仪，电流强度为1 mA，波型选择1/20 Hz 频率的疏密波，电压峰值为6 V，以针体轻轻抖动为判断电针得气标准，20 min/次，每天同一时间治疗1 次，连续7 d。治疗结束后放回笼中正常饲养，至7 d 后处死动物取材。（2）模型组：造模结束后回笼饲养，不予任何治疗。（3）假手术组：手术后回笼饲养，不予任何治疗。

1.5 行为学评定

各组大鼠在脑缺血再灌注后2 h 及电针治疗第7 天，由1 名对研究不知情的观察者按Zea Longa评分［10］评估神经功能改善情况，评分标准：0 分，正常，无神经缺损；1 分，对侧前爪不能完全伸展；2 分，活动时向外侧转圈；3 分，行走不稳，不自主向对侧倾倒；4 分，完全不能行走，甚至意识丧失。

1.6 取材和指标检测

1.6.1 取材 干预7 d 后取材，各组大鼠在10%水合氯醛3.5 mL/kg 腹腔注射麻醉下行开颅，取出的大脑组织迅速保存在-80 ℃冰箱中，或固定后制成石蜡标本备用。

1.6.2 HE 染色 取各组大鼠缺血区域脑组织置于4%多聚甲醛内，4 ℃固定24 h。常规脱水，石蜡包埋，冠状切片，片厚5 µm。常规梯度脱蜡入水，脱蜡后苏木精-伊红（HE）染色并用中性树脂封片，于显微镜下观察各组形态病理学改变。

1.6.3 Western blot 法检测PINK1、Parkin 提取各组50 μg 左侧大脑皮质区脑组织，加入RIPA 裂解液（RIPA∶PMSF=100∶1），充分研磨裂解。匀浆后于冰上静置30 min，4 ℃、12 000 r/min 离心10 min 后分离上清液，提取全蛋白提取物。用BCA 法检测所提取的蛋白浓度。用SDS-PAGE 凝胶电泳，考马斯亮蓝染色标记蛋白质分子量标准，转膜，用封闭液封闭2 h，加入相应的一抗PINK1（1∶1 000 稀释）、Parkin（1∶2 000 稀释），4 ℃孵育过夜；次日洗涤，加入HRP（辣根过氧化物）标记的二抗（1∶5 000稀释），振荡孵育2 h，TBST 洗涤，将膜置于透明塑料板上，将膜蛋白面朝下与混合好的化学荧光发光底物充分接触，去尽残液，采用凝胶成像系统显影成像与分析，内参蛋白为GAPDH，目的蛋白的相对表达量为目的蛋白与内参蛋白的比值。

1.6.4 TUNEL 检测细胞凋亡数 按TUNEL 试剂盒检测说明书上操作处理：将脑组织石蜡标本切成约3 μm 厚的切片组织，于玻片上固定。于60 ℃烘箱中烤片后进行二甲苯脱蜡及乙醇溶液梯度水化。封片观察，在显微镜下观察并采集图像，计算TUNE 阳性细胞数量。

1.7 数据处理及统计学分析

所收集的数据采用SPSS 25.0 统计软件分析，计量资料均以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较方差齐用LSD 检验，方差不齐用Dunnett's T3 检验。以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能缺损评分比较

假手术组大鼠无神经功能缺损，均为0 分；造模后，与假手术组相比，模型组与电针组大鼠神经功能缺损评分均明显升高（P＜0.05），但模型组与电针组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；经电针干预治疗，电针组大鼠神经功能缺损评分较模型组显著降低（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠神经功能缺损评分比较（±s，n=15）分

表1 各组大鼠神经功能缺损评分比较（±s，n=15）分

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

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2.2 各组大鼠脑皮质区神经元结构变化比较

假手术组神经元排列整齐，分布均匀，神经元胞体较大，未见明显空泡，核呈圆形，核仁清晰可见；模型组神经元皱缩，分布凌乱，胞质变形缩小，结构不清，核固缩，呈三角形，细胞周围间隙增宽，可能是炎性细胞；电针组神经细胞核皱缩或碎裂有所减少，细胞浸润减少，一定程度上减轻缺血再灌注所致的病理损伤。见图2。

图2 各组大鼠脑皮质区HE染色结果（20×）

2.3 各组大鼠脑缺血皮质区PINK1、Parkin 蛋白表达比较

与假手术组相比，模型组大鼠脑缺血皮质区线粒体自噬蛋白PINK1、Parkin 表达明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，电针组大鼠皮质组织PINK1、Parkin水平进一步升高（P＜0.01），表明电针可上调PINK1、Parkin 表达，激活线粒体自噬。见图3。

图3 各组大鼠脑缺血皮质区PINK1、Parkin蛋白表达比较

2.4 各组大鼠脑皮质区细胞凋亡率的比较

与假手术组相比，模型组细胞凋亡率明显升高（P＜0.01），而电针组的细胞凋亡率较模型组明显下降（P＜0.05）。见图4。

图4 各组大鼠脑皮质区细胞凋亡率的比较

3 讨论

中医学认为，中风病的基本病机总属阴阳失调，气血逆乱，主要病位在脑，临床上常表现为半身不遂、偏身麻木等。根据《素问·痿论》“治痿独取阳明”理论，曲池和足三里均是阳明经上的合穴，对治疗缺血性中风具有良好的临床疗效，这已在大量临床研究中得到证实［12］。脑缺血再灌注损伤大鼠模型（MCAO 模型）产生的神经功能缺损症状与脑缺血患者的临床症状相似，常伴有肢体的运动及感觉障碍等。本研究结果显示，电针可以改善神经功能缺失症状，减少脑缺血再灌注损伤大鼠的炎性反应，神经行为学评分及病理学结果很好地证实了这一点，这与既往报道相符［13-14］，表明电针具有治疗脑缺血再灌注损伤的作用。

脑缺血再灌注损伤会产生钙离子超载、炎性反应、细胞凋亡、自由基氧化损伤等在内的一系列复杂反应，最终导致细胞死亡［15］。线粒体作为细胞内的关键细胞器，在细胞能量产生、氧化磷酸化、细胞死亡等过程中起重要的作用，其作为细胞能量代谢的中心，为大脑提供重要的能量。大量研究表明线粒体受损会加重缺血性脑损伤神经元细胞的凋亡［16］。因此，及时对受损的线粒体进行清除可以有效减轻脑缺血再灌注损伤。当前国内外研究发现，线粒体自噬是机体通过特异性自噬将受损线粒体消除的重要方式之一［17-18］。而在脑缺血灌注过程中线粒体自噬受多种蛋白的调节，其中，PINK1/Parkin 通路调控的线粒体自噬途径最为典型［19］。Parkin 主要通过介导底物泛素化进行信号传导，调节蛋白降解等而诱发线粒体的自噬，PINK 是受损伤线粒体的分子感受器，可通过募集并活化Parkin 进一步引发线粒体自噬，是线粒体受损时的第一道防线。已有研究揭示，在脑缺血再灌注损伤中，当线粒体自噬发生时，脑神经元细胞内PINK1 蛋白表达升高，Parkin 被活化，Parkin 敲除后，PINK1 也可通过泛素蛋白磷酸化诱导低水平线粒体自噬，这表明Parkin 的存在会增加PINK1诱导的信号通路，增强线粒体自噬过程［20］。本动物实验中，造模成功后大鼠脑组织中的线粒体自噬蛋白PINK1、Parkin 的表达水平升高，说明脑缺血再灌注损伤后存在自噬蛋白的活化，这与此前大量的研究报道一致［21-22］。而进一步研究发现，电针干预后可进一步提高PINK1 及Parkin 蛋白水平，这表明在脑缺血再灌注损伤中，电针可能通过上调PINK1/Parkin 通路介导的线粒体自噬水平发挥神经保护作用。

最新研究表明，线粒体受损可以通过促进脑缺血再灌注损伤的炎症联级反应，引发细胞凋亡，从而加重脑损伤［23］。已有研究证实PINK1/Parkin 介导的线粒体自噬作为一种清除受损线粒体的途径，在脑缺血再灌注中起重要作用［24］。通过激活线粒体自噬可以减轻脑缺血神经元损伤，进而减少线粒体依赖的细胞凋亡，这已经在体内模型和培养的神经元中得到证实［25］。故本课题组进一步应用TUNEL 染色法检测电针对脑缺血再灌注区细胞凋亡的影响。结果表明MCAO 组大鼠脑缺血区存在大量细胞凋亡，电针干预后细胞凋亡数明显减少，神经功能缺损症状明显改善，与相关研究一致。这也表明电针通过介导线粒体自噬途径减轻脑缺血再灌注损伤神经细胞的凋亡。

综上所述，本研究结果表明，电针MCAO 大鼠曲池、足三里可能通过激活Parkin 介导的线粒体自噬途径减少细胞凋亡，减轻脑缺血再灌注神经损伤，从而起到脑保护的作用。但调控线粒体自噬的信号通路多样，电针能否通过其他途径调控线粒体自噬产生神经保护作用，其具体作用机制仍需进一步研究。