富马酸二甲酯通过Nrf2/HO-1信号通路缓解细颗粒物对雌性大鼠胎盘的氧化损伤

李江珂, 董恩恒, 张丰泉, 张俊强, 伍 源

(新乡医学院公共卫生学院新乡市大气污染健康效应与干预重点实验室,河南 新乡 453003)

细颗粒物(fine particulate matter,PM2.5)是指空气动力学直径不超过2.5 μm的微小颗粒物[1]。与较大的颗粒物相比,PM2.5粒径小,活性强,容易富集各种微生物和有害化学物质,这些特性能使PM2.5经呼吸道透过肺泡并进入血液,对人体健康产生不良影响[2]。有研究报道,孕前和妊娠早期PM2.5暴露被认为是胎儿生长的敏感时期[3]。此外,母体暴露在空气污染物中也逐渐成为不良妊娠结局的一个关键因素[4]。近年来,已有大量的流行病学调查证实,孕产妇暴露于PM2.5可能导致妊娠并发症和不良妊娠结局的风险增加,包括先兆子痫(preeclampsia,PE)[5,6]和低出生体重(low birth weight,LBW)[7]等。

颗粒物暴露可以引起机体内活性氧(reactive oxygen species,ROS)等自由基的增加,同时抑制生物体内抗氧化剂的产生,从而诱发氧化应激反应。氧化和抗氧化之间的平衡在维持生物体内环境稳态方面有着至关重要的作用。由于机体对脂质过氧化的易感性,机体在面对外来物质入侵时已经形成了一套有效的抗氧化系统,包括总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)、超氧化物歧化酶(super oxide dismutase,SOD)在内的其它抗氧化剂。这些抗氧化物质会以不同的方式阻止自由基对生物分子的有害攻击,维持组织细胞功能的完整性[8]。富马酸二甲酯(dimethyl fumarate,DMF)是一种非阿片类的口服药物,常用于治疗神经性炎症和线粒体功能障碍[9]。DMF目前已广泛用于治疗多发性硬化症等相关疾病[10],且在神经炎症和毒性氧化应激的临床前模型中表现出良好的效果[11]。研究表明,DMF能够激活核因子E2相关因子(NF-E2 related factor 2,Nrf2)信号通路[12],这是一个重要的机体防御系统。Nrf2是编码许多抗氧化基因和解毒酶的主要调节者,可调节机体细胞的氧化应激反应[13]。当机体受到外源性物质胁迫时,Nrf2会迁移到细胞核,与抗氧化反应原件(antioxidant response element,ARE)启动子区域结合,来调控血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)、SOD等下游基因的表达,以对抗ROS,从而保护正常细胞免受细胞毒效应的影响[14]。在氧化应激调节中,Nrf2发挥着重要的作用。尽管目前有很多关于生殖方面的研究,但大多集中在流行病学和妊娠结局方面。胎盘作为胚胎发育过程中的关键器官,对其进行研究可以揭示出PM2.5对胎鼠健康的潜在风险,这有助于更深入地了解PM2.5对大鼠生殖系统的影响。因此,本文研究选用不同剂量的PM2.5,探究孕前PM2.5暴露对大鼠胎盘损伤及可能的机制,并评估DMF对孕前PM2.5暴露生殖损伤的抑制效果,从而对PM2.5诱导的生殖毒性的预防与干预提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

40只6周龄的SPF级雌性SD大鼠,体重为160～200 g,14只6周龄的SPF级雄性SD大鼠,体重为240 g～340 g,均购于北京维通利华实验动物技术有限公司[动物生产许可证号:SCXK(京)2021-0011;动物使用许可证号:SYXK(京)2022-0052]。所有实验大鼠都在室内温度22～24 ℃,标准饮水、进食及明暗交替的SPF级屏障环境中饲养。本研究已获得新乡医学院伦理委员会批准(XYLL-20210521)。

1.2 主要试剂与仪器

DMF购于美国MCE生物科技公司(HY-17363);SOD、丙二醛(malondialehyde,MDA)试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司(BC0175,BC0025);BCA蛋白浓度测定试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司(PC0020);T-AOC试剂盒购于武汉伊莱瑞特生物科技公司(E-BC-K136-M);白细胞介素-6(interleukin 6,IL-6)和白细胞介素-10(interleukin,IL-10)试剂盒购于武汉伊莱瑞特生物科技公司(E-EL-R0015c,E-EL-R0016c);Nrf2、HO-1、β-肌动蛋白(β-actin)抗体购于江苏亲科生物有限公司(AF0639,AF5393,AF7018)。大流量粉尘采样器(Tisch Environmental美国);真空冷冻干燥机(2-4LD Plus,德国Marin Christ公司);电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS,美国Thermo公司);酶标仪(Enspire,美国PerkinElmer公司);凝胶成像系统(Fluor Chem R,美国Protein Simple)。

1.3 PM2.5的检测

使用聚四氟乙烯滤膜采集2022年4月17日至2022年9月17日新乡市的PM2.5样本。本文通过ICP-MS对染毒所用的PM2.5进行了金属成分分析。取1 mg的PM2.5粉末,加入3 mL HNO3和2 mL H2O2进行混匀。使用微波消解仪充分消解。消解完成进行赶酸,用超纯水稀释赶酸液,采用ICP-MS分析PM2.5中的各金属元素含量。

1.4 动物分组及染毒方法

采用随机数字法将实验动物分为对照组(生理盐水,Cont)、低剂量PM2.5组(1.5 mg/kg bw PM2.5,L-Exp)、高剂量PM2.5组(7.5 mg/kg bw PM2.5, H-Exp)、DMF对照组(生理盐水+50 mg/kg bw DMF,DMF Cont)和DMF干预组(7.5 mg/kg bw PM2.5+50 mg/kg bw DMF,H-Exp+DMF)。将收集的PM2.5用生理盐水配置成不同浓度的混悬液,采用吸入式气管滴注法进行大鼠PM2.5染毒。具体实验操作方法可见课题组前期研究内容[15]。30 min时,对照组、低剂量PM2.5组和高剂量PM2.5组大鼠灌胃生理盐水,DMF对照组与DMF干预组大鼠灌胃DMF。染毒结束时,将大鼠放回鼠笼,自由饮水和进食,每2 d染毒1次,共持续染毒40 d。之后,将雄雌大鼠按照1∶2的比例进行合笼。当妊娠第19 d时,将雌鼠麻醉并解剖,通过心血管采血法收集血液,同时立即收集胎盘组织样本。

1.5 胎盘病理组织观察

将取出的新鲜胎盘组织用PBS充分漂洗,固定样本,包埋后制作(5～6 μm)的石蜡切片,H&E染色,观察大鼠胎盘组织病理学变化。

1.6 胎盘组织超氧化物歧化酶、丙二醛、总抗氧化能力含量测定

取0.1 g新鲜胎盘组织,按1∶5～10的比例加入提取液,冰上剪碎组织,用高速低温组织研磨仪制备组织匀浆液,8 000×g/4 ℃离心10 min,取组织上清液,置冰上待测。严格按照试剂盒说明,采用微量法检测SOD活性及MDA含量,分别在560 nm、532 nm及600 nm波长处用酶标仪测量吸光度。取0.1 g新鲜胎盘组织,按1∶5比例加入(0.5 mL)PBS,匀浆离心后,取组织上清液待测。采用比色法试剂盒检测T-AOC含量,于520 nm波长处测量测定孔和对照孔的吸光度。

1.7 胎盘组织IL-6、IL-10含量测定

取0.1 g新鲜胎盘组织,按1∶5的比例加入PBS,冰上剪碎组织,将胎盘组织用高速低温组织研磨仪制备成组织匀浆液。8 000×g/4 ℃离心15 min,取组织上清液,置冰上待测。严格按照试剂盒的说明,采用双抗体夹心法检测IL-6和IL-10的含量,酶标仪于450 nm波长处检测酶标板中的标准品孔和样品孔吸光度,在双对数坐标轴上分别绘制出IL-6和IL-10的四参数逻辑函数的标准曲线并计算样品中IL-6和IL-10的浓度。

1.8 胎盘组织核因子E2相关因子、血红素加氧酶-1的蛋白质水平测定

取40 mg新鲜胎盘组织,按1∶10的比例加入400 μL RIPA裂解液和4.0 μL的PMSF,冰上剪碎组织,将胎盘组织用高速低温组织研磨仪制备成组织匀浆液,70Hz研磨3～5 min,置冰上30 min,12 000 r/min,4 ℃离心15 min,取组织上清液,分装保存,用BCA法定量总蛋白质浓度。制备浓度为8%的分离胶和5%的浓缩胶进行SDS-PAGE凝胶电泳,按照30 μg蛋白质样品准确上样,转膜,封闭,加入一抗Nrf2(1∶2 000)、HO-1(1∶1 000)、β-肌动蛋白(1∶3 000),80 r/min室温摇2 h。洗膜后加入二抗(1∶4 000),80 r/min室温摇1 h。洗膜后,ECL发光,多功能成像系统成像,用ImageJ软件进行灰度比值分析。以β-肌动蛋白为内参蛋白质,比较Nrf2、HO-1蛋白质的相对表达水平。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 新乡地区细颗粒物中铝、镁、钙、铁、锌5种元素质量浓度最高

PM2.5对机体健康的影响受到多种因素作用,与其组分浓度密不可分。ICP-MS结果显示:新乡地区夏秋季PM2.5中的铝(aluminum,Al)、镁(magnesium, Mg)、钙(calcium, Ca)、铁(iron,Fe)、锌(zinc, Zn)等这5种元素的质量浓度最高,分别为32.94834、14.59629、7.415467、3.89415、3.52989 μg/mg (Table 1)。

Table 1 Analysis of the metal composition in PM2.5

2.2 富马酸二甲酯对大鼠的胚胎发育具有保护作用

研究结果与对照组相比,高剂量PM2.5组的胎鼠数量降低,差异具有统计学意义(P<0.05);与高剂量PM2.5组相比,DMF干预组的胎鼠数量明显增多,是高剂量PM2.5组的1.16倍(P<0.05)。胚胎体长是很多研究常用的指标,可作为胚胎发育状况的参考指标。与对照组相比,低剂量PM2.5组(P<0.05)和高剂量PM2.5组(P<0.01)的胎鼠平均体长都有不同程度的降低;与高剂量PM2.5组相比,DMF干预组的胎鼠平均体长明显增高,为高剂量PM2.5组的1.10倍(P<0.001)。上述结果表明,PM2.5可以通过胎盘屏障导致胚胎毒性的发生,DMF能抑制由PM2.5带来的胚胎毒性,对胚胎发育具有保护作用(Fig.1)。

Fig.1 The effect of PM2.5 exposure in different doses and DMF intervention in fetal rats (A) Analysis of the number of fetal rats among different groups. (B) ImageJ software analysis of the average body length of fetal rats among groups. Data were presented as mean ± SD (n = 8).**P<0.01,*P<0.05 vs Control group; ###P<0.001,#P<0.05 vs H-Exp group

2.3 富马酸二甲酯减轻PM2.5暴露对胎盘组织的病理损伤

由病理结果显示,与对照组相比,低剂量PM2.5组和高剂量PM2.5组胎盘的迷路区血细胞有不同程度的减少,给予DMF干预后,与高剂量PM2.5组相比,DMF干预组胎盘迷路区的血细胞增多。且与对照组和DMF干预组相比,高剂量PM2.5组的血管脉径不清晰,结果表明,PM2.5暴露可导致胎盘组织结构发生病理改变,而DMF可以改善因PM2.5暴露导致的胎盘病理损伤(Fig.2)。

Fig.2 Effects of PM2.5 exposure and DMF intervention on placental pathology Pathological changes in placental tissues were detected using the H&E staining method. (A) The impact on blood cells is indicated by the black arrow, which indicated blood cells. (B) The impact on the vascular vein. The blue arrow indicates the vascular vein. Scale bar, 20 μm or 40 μm as described in figures

2.4 富马酸二甲酯减轻PM2.5暴露诱导的胎盘氧化应激反应

由氧化应激结果表明,与对照组相比,高剂量PM2.5组的MDA含量显著增高(16.5 ± 2.85,P<0.05)。与对照组相比,高剂量PM2.5组SOD活性(41.34±8.36)和T-AOC含量(0.75 ± 0.17)明显降低(P<0.05),经DMF处理后,DMF干预组的T-AOC显著高于高剂量PM2.5组(1.32 ± 0.38,P<0.01)。结果表明,PM2.5暴露可以导致机体抗氧化能力降低,通过DMF进行干预能有效的提高机体的抗氧化能力(Fig.3)。

Fig.3 Indicators related to placental oxidative stress (A) SOD activity in placental tissues was detected by the microassay. (B) The content of MDA in placental tissues was detected by the micromethod. (C) T-AOC was detected by colorimetry. Data were presented as mean ± SD (n = 6).**P<0.01,*P<0.05 vs Control group;##P<0.01,#P<0.05 vs H-Exp group

2.5 PM2.5暴露能导致机体抗炎水平降低

由炎症因子检测的结果显示,PM2.5暴露后,与对照组相比,不同剂量组的IL-6含量随着PM2.5浓度的增加而增加,呈现剂量效应的趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组相比,低剂量PM2.5组IL-10含量(2 714.74 ± 501.28)、高剂量PM2.5组的IL-10含量(2 657.66 ± 279.64)都明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。与高剂量PM2.5组相比,DMF干预组的IL-10水平增高,但差异无统计学意义(P>0.05)。这表明PM2.5暴露能导致机体抗炎能力下降,但DMF的干预在提高机体的抗炎能力方面并未表现出显著的效果(Fig.4)。

2.6 富马酸二甲酯增高Nrf2/HO-1信号通路的胎盘蛋白质表达水平

为了研究Nrf2/HO-1信号通路在PM2.5诱导的胎盘氧化应激中的作用,本文用Western印迹法检测了Nrf2和HO-1蛋白质的表达量。结果显示,低剂量PM2.5组Nrf2(0.99 ± 0.17)和高剂量PM2.5组Nrf2(0.86 ± 0.11)、低剂量PM2.5组HO-1(0.95 ± 0.16)和高剂量PM2.5组HO-1(0.85 ± 0.06)的蛋白质水平都明显低于对照组(P<0.01);与高剂量PM2.5组相比,DMF干预组的Nrf2(1.06 ± 0.10)、HO-1(1.04 ± 0.17)蛋白质的表达量都明显增高(P<0.05),差异具有统计学意义。结果表明,PM2.5暴露能使Nrf2、HO-1蛋白质的含量降低,而DMF干预组的Nrf2、HO-1蛋白质的含量增高,提示DMF可能通过Nrf2/HO-1信号通路提高机体抗氧化酶的蛋白质水平(Fig.5)。

Fig.5 Indicators related to placental protein expression The expression levels of Nrf2 and HO-1 in placental tissues were detected by Western blotting. Data were presented as the mean ± SD of three independent experiments (n=6).**P<0.01,*P<0.05 vs Control group;##P<0.01,#P<0.05 vs H-Exp group

3 讨论

空气污染是一个重大的全球公共卫生问题,由环境污染物引起的健康问题不容小觑。目前越来越多的数据表明,孕期接触环境空气污染与早产、LBW等一系列不良妊娠结局密切相关[16,17]。一项新的研究[18]甚至发现,孕妇产前PM2.5暴露每增加1 μg/m3,胎儿死亡的风险显著增加8%。尽管与空气污染有关的不良妊娠结局的机制尚未完全阐明,但有研究提示胎盘是受空气污染直接影响的主要器官[19]。一项针对健康孕妇的研究发现,产前PM2.5暴露与胎盘整体DNA甲基化呈正相关[20]。此外,血液中的环境污染物也可能直接穿过胎盘屏障,引发缺氧或免疫介导的损伤,最终导致胎儿死亡[21]。在一项对PM2.5金属成分和死产风险之间关系的评估中,研究观察到锌的含量与死产密切相关[22]。随后,本文采用ICP-MS分析新乡地区PM2.5的金属成分,发现PM2.5中不同金属元素质量浓度差异较大,其Al、Mg、Ca、Fe、Zn含量较高,Al和Fe是地壳中含量代表性元素,而Zn元素是由车辆轮胎磨损产生[23]。这表明扬尘风沙可能是构成新乡细颗粒物的主要贡献者。

研究证实,氧化应激、炎症反应和DNA损伤等是PM2.5导致机体损害的主要机制[24]。通常情况下,机体内的氧化和抗氧化水平是保持动态平衡的,但当受到外来物质入侵时,机体内自由基水平会显著升高,导致氧化应激反应。通过检测MDA水平和SOD活性来评估PM2.5诱导的氧化损伤和抗氧化能力是一个重要的手段[25]。本研究发现,高剂量PM2.5组SOD活性与对照组相比明显降低,高剂量PM2.5组的MDA与对照组相比,含量显著增高,差异均具有统计学意义。T-AOC是反映机体的总抗氧化能力,本文所测T-AOC指标结果显示,高剂量PM2.5组的抗氧化能力减弱,而DMF干预组的总抗氧化能力与高剂量PM2.5组相比显著增高,差异具有统计学意义。实验数据表明,高浓度PM2.5的暴露会引起大鼠胎盘组织发生氧化应激反应,通过DMF给药可以逆转这一现象,使机体的抗氧化能力增高。研究表明,短期给予DMF能显著抑制巨噬细胞的炎症反应[26]。根据本文的研究结果,促炎因子IL-6的水平随着PM2.5暴露浓度的增加呈剂量效应性增高的趋势,然而并未显示出统计学意义。IL-10是反映机体抗炎能力的指标,与对照组相比,低剂量PM2.5组、高剂量PM2.5组显著降低,具有统计学意义,这与文献中研究结果一致[27]。与高剂量PM2.5组相比,DMF干预组IL-10含量有增高的趋势。这表明机体的抗炎能力受到PM2.5的暴露而减弱,然而,就提升机体的抗炎机能而言,DMF的效果并不明显。

Nrf2是碱性亮氨酸拉链(basic leucine zipper,bZip)转录因子的家族成员[28],它在抗氧化防御、氧化信号传导、代谢、细胞增殖等方面发挥重要作用。在生理条件下,自噬、坏死和细胞程序性死亡均受抗氧化系统的调节,而抗氧化系统则受到Nrf2/HO-1的调节,但这种保护作用主要发生在细胞质中[29]。当机体组织中Keap1表达缺失或降低,会导致Nrf2泛素化-蛋白酶体降解失衡,从而增加细胞内Nrf2蛋白的含量,将Nrf2移位到细胞核,进而激活其下游HO-1的表达[30]。HO-1是血红素加氧酶的一个亚型,参与了游离铁诱导的血红素分解为胆红素。作为ARE调控的主要抗氧化剂基因,HO-1及其代谢产物具有抗氧化、抗炎和信号转导等功能,并在人体各种器官中广泛表达[14]。尽管有许多研究对DMF作为Nrf2激活剂的作用和有效性进行了广泛探讨,但只有少数数据评估了DMF的作用[31]。Sun等人[32]发现,口服DMF可减轻神经炎症,并提高Nrf2和抗氧化酶(例如SOD、HO-1)的水平。但因其在生殖系统较少涉及,通过查阅文献我们发现,目前,仍未见因DMF导致不良妊娠结局的相关研究[33]。由此本文假设,DMF给药可以缓解胎盘氧化应激和炎症反应。通过Western 印迹检测,本文测定了Nrf2及其下游因子HO-1的蛋白质含量。本文结果显示,低剂量PM2.5组和高剂量PM2.5组的Nrf2、HO-1明显低于对照组,与高剂量PM2.5组相比,DMF干预组Nrf2、HO-1蛋白质含量增多,差异均有统计学意义。本文观察到DMF逆转了PM2.5诱导的Nrf2的下调。根据Fan[34]等人报告,PM2.5暴露后Nrf2蛋白量减少,而其他研究则表明,Nrf2含量被PM2.5上调[35]。这些相互矛盾的发现可以用以下原因解释,当PM2.5诱导的氧化应激和炎症反应随着时间的推移而逐渐发展且代偿能力不足时,Nrf2蛋白的含量及表达可能会降低。在本文的研究中发现,PM2.5暴露导致Nrf2蛋白的含量减少,同时抑制了参与细胞防御系统的抗氧化因子HO-1的表达,DMF的干预增高了Nrf2和HO-1在大鼠胎盘的表达水平。

本文研究发现,环境中PM2.5的暴露可导致胎鼠数量减少、胎鼠平均体长较短,胎盘结构发生改变等。这表明PM2.5的暴露可能对机体产生一定程度的胚胎毒性,而DMF的给予明显的缓解了这种胚胎毒性。研究结果显示,孕前PM2.5暴露能够引起胎盘组织氧化损伤及抗炎因子水平的降低,而DMF的干预能够明显的减轻因PM2.5暴露对大鼠胎盘造成的氧化损伤,提高机体的抗氧化能力。这些数据表明,通过改善Nrf2及其下游因子HO-1的蛋白质水平,DMF可能保护组织细胞免受PM2.5诱导的氧化损伤。因此,我们推测,Nrf2/HO-1信号通路可能参与了DMF对PM2.5诱发的生殖毒性的抗氧化保护作用。