组织块贴壁法提取胎盘、脐带和胎膜间充质干细胞效果观察

马海英,李 丽,马 玲,魏文娟,金玉楠,卢晓梅,杜莉莉,于艳秋

(中国医科大学基础医学院病理生理教研室,沈阳 110001)

间充质干细胞(MSCs)是具有自我更新能力且能够向多个方向分化的干细胞。目前已从骨髓、脂肪、羊膜、胎盘、脐血以及脐带等组织中分离出MSCs[1],其有向骨、软骨、脂肪、肌肉和神经组织分化的能力[2]。自 2008年以来,我们采用组织块种植贴壁培养法培养胎盘、脐带和羊膜来源的MSCs,观察不同来源的MSCs原代及传代培养的细胞生长特性,旨在为临床移植组织工程等提供足够数量的种子细胞。

1 材料与方法

1.1 材料 12份胎盘、脐带和羊膜样本均来自沈阳菁华医院妇产科健康足月妊娠产妇(经医院伦理委员会许可和产妇知情同意),产妇年龄 23～35周岁,无家族性疾病、传染性疾病和感染性疾病,妊娠时间 37～42周。均为剖腹产,男婴 7例,女婴 5例,均足月健康。主要试剂：胎牛血清(FBS)、非必需氨基酸(MEM),L-谷氨酰胺,青、链霉素,β-巯基乙醇、0.25%胰酶,MTT细胞周期试剂盒。

1.2 MSCs提取 采用组织块贴壁法。①胎盘：无菌条件下取足月胎盘小叶,PBS冲洗去除红细胞,去除羊膜及蜕膜,选择颜色鲜艳无瘀血的间质组织,剪成1 cm3大小,继续PBS冲洗,剪碎,剔除血管、结缔组织,剪成肉糜状组织块,置于50 ml离心管内300 r/min,离心5min,弃上清,再次离心至上清液无红色为止。将组织块接种于10 cm2培养皿(每份样本种植5个培养皿)中,间隔0.5 cm,超净台内放置10～20min,待组织块表面干燥时,小心加入6m l含非必需氨基酸(0.1 mmol/L),L-谷氨酰胺(2 mmol/ L),1×105U/L青霉素、链霉素,β-巯基乙醇(0.1 mmol/L)及10%胎牛血清的高糖DMEM培养基,在37℃、5%CO2的孵箱内培养,每 3～5 d换液1次;待细胞80%融合后,去除组织块,加入0.25%EDTA胰酶消化传代培养。之后每代细胞 80%融合后0.25%EDTA胰酶消化3 min,1 000 r/min离心5 min,1∶3传代。②脐带：无菌条件下取脐带 4～5 cm,4℃保存,于超净台中取出脐带,PBS冲洗去除红细胞,剪开管腔,小心剔除脐带内外膜,取管壁肌层,剪碎成肉糜状,置于50ml离心管内300 rpm,离心5 min,弃上清,将组织块接种于10 cm2培养皿中,间隔0.5 cm,超净台内放置10～20m in,待组织块表面干燥时,加入DMEM培养基培养,余者同①换液传代。③胎膜：无菌条件下取1～2块10 cm2大小胎膜,4℃保存,于超净台中取出胎膜,PBS冲洗,剪碎成肉糜状,置于50ml离心管内300 rpm,离心5 min,弃上清,将组织块接种于10 cm2培养皿中,间隔0.5 cm,超净台内放置10～20 min,待组织块表面干燥时,加入DMEM培养基培养,余者同①换液传代。

1.3 相关指标观察 ①细胞形态：光镜下观察;②细胞最早爬出、原代提取成功率及鹅卵石样细胞比例：显微镜下观察细胞最早爬出时间,原代提取成功率 =有细胞爬出的培养皿数/12份样本 ×5个培养皿;鹅卵石样细胞比例=有鹅卵石样细胞爬出的培养皿数/有细胞爬出的培养皿数。当组织块培养 28 d仍无细胞爬出,认为原代提取成功率为 0,终止培养。③细胞生长曲线绘制：取原代培养后第 1代细胞(P1)与传代第5代细胞(P5),0.25%胰酶消化后,接种于 8块 96孔板中,每孔接种 2 000个细胞, 100μl培养基,接种后 4 h取出第一块测得值计为第0天,之后7 d每天取出1块采用MTT法测定波长490 nm处吸光度值,设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜),每组5个复孔,所得吸光度值减去调零孔吸光度值为终末值,以该终末值绘制细胞生长曲线。

1.4 统计学方法 采用SPSS 11.0统计软件,计量数据以±s表示,组间比较采用独立样本t检验,P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞形态 起初少量细胞沿组织块周边爬出,呈短梭形,形态饱满;随后细胞向外扩张,呈长梭形,少量呈鹅卵石状,并逐渐形成漩涡状的集落。其中,脐带鹅卵石样细胞较胎膜和胎盘多(P＜0.05),胎膜和胎盘之间无明显差异(表1)。细胞生长基本融合后传代,随着传代次数的增加,鹅卵石样细胞、短梭形细胞逐渐消失,细胞均呈长梭形条索状生长,排列紧密生长旺盛。

表1 三种标本细胞爬出最早时间及原代提取成功率、鹅卵石样细胞比例(±s)

表1 三种标本细胞爬出最早时间及原代提取成功率、鹅卵石样细胞比例(±s)

注：与脐带及胎膜比较,＊P＜0.05;与胎膜比较,△P＜0.05;与胎膜及胎盘比较,#P＜0.05;与胎膜及胎盘比较,○P＜0.05

标本 细胞爬出最早时间(d)原代提取成功率(%)鹅卵石样细胞比例(%)胎盘 12.6±4.19＊ 0.76±0.032 0.12±0.019脐带 17.2±2.45△ 0.43±0.059﹟ 0.36±0.040○胎膜 9.4±3.24 0.83±0.013 0.18±0.031

2.2 细胞最早爬出、原代提取成功率及鹅卵石样细胞比例 细胞爬出最早时间：胎膜细胞为第 4天,胎盘为第9天,脐带为第 15天。不同来源细胞最早爬出平均时间、原代提取成功率、鹅卵石样细胞比例见表1。

2.3 细胞生长曲线 见图2。P1代时,三种细胞生长较为缓慢,胎膜MSCs较胎盘、脐带生长快(P＜0.05),脐带和胎盘间相比无明显差异。P5代时,三组细胞生长均增快,细胞进入对数生长期,三者间比较无显著差异。

图2 胎盘、脐带和胎膜提取MSCs细胞生长曲线

3 讨论

MSCs是一种多能非造血干细胞,是目前细胞和组织工程领域研究的热点。本研究室亦证实人胎盘来源的MSCs具有同骨髓MSCs相似的免疫表型以及向骨、软骨等分化的能力[3,4]。胎盘、脐带作为胚胎发育中维系母体和胎儿营养物质交换的重要暂时性器官,在胎儿娩出后即完成使命,以往常被作为医疗废弃物。近年来发现,用其提取干细胞对产妇及胎儿均无不利影响,且来源广。现已成为再生医学种子细胞的重要来源。

目前,从胎盘、胎膜、脐带中提取MSCs较通用的方法有酶消化法和组织块贴壁法。两种方法分离的MSCs形态、生长速率、细胞表面标记特征等无明显差异,而酶消化法因操作过程繁琐致污染机率增加,且长时间酶的消化对细胞损伤较大,成本较高[5]。故本研究采用组织块培养法提取胎盘、脐带和胎膜中的MSCs,通过比较细胞形态、细胞最早爬出时间以及原代提取成功率等方面,对比组织块种植法提取MSCs的效果。结果表明,组织块种植法提取的细胞形态有长梭形和卵圆形两类,逐渐形成漩涡状的集落。随着传代次数的增加,卵圆形、短梭形细胞逐渐消失,细胞均为长梭形条索状,即表现为均一的成纤维细胞样形态,排列紧密可单层融合生长。组织块种植时组织块周边胎膜细胞最早爬出,脐带最晚,且脐带原代提取成功率较低、卵圆形细胞比例大,此可能与脐带为血管管壁,其管壁较韧,硬度较大,组织块难于贴壁有关。而胎膜较薄,与胎儿、羊水直接接触,故从中获得的MSCs更接近于胎儿来源、形态较单一,P1代生长较为迅速,但仍处于缓慢增殖期。传代后,多种形态的细胞逐渐消失,细胞成为长梭形成纤维细胞样,同时细胞逐渐进入增殖旺盛期,P5代时细胞生长曲线所示。

综上所述,利用组织块种植贴壁培养法可以成功的从胎盘、胎膜中提取出MSCs,提取传代培养后的细胞形态单一,增殖旺盛,可获得足够数量的干细胞。

[1]Keating A.Mesenchymal stromal cells[J].Curr Opin Hematol, 2006,13(6)：419-425.

[2]Cargnoni A,Gibelli L,Tosini A,et al.Transplantation of Allogeneic and Xenogeneic Placenta-Derived Cells Reduces Bleomycin-Induced Lung Fibrosis[J].Cell Transplant,2009,18(4)：405-422.

[3]Yu YQ,LiK,BaoC,etal.Exvitroexpansion of human placenta-derived mesenchymal stem cells in stirred bioreactor[J].Appl Biochem Biotechnol,2009,159(1)：110-118.

[4]于艳秋,李昆,金玉楠,等.人胎盘来源的干细胞提取及其向心肌细胞分化的实验研究[J].中国病理生理杂志,2007,23(5)：865-867.

[5]李昆,于艳秋,李世正.两种分离人胎盘间充质干细胞方法的比较[J].中国医科大学学报,2010,39(5)：675-676.