高效液相法同时测定葡萄酒中3种防腐剂和2种甜味剂

杭 莉

（泰州市疾病预防控制中心,江苏 泰州 225300）

食品添加剂是为改善食品品质和色、香、味，以及为防腐、保鲜和加工工艺的需要而加入食品中的人工合成或者天然物质[1]。目前在食品工业中发挥越来越重要的作用。也许正由于这种可观利润的诱惑，食品添加剂滥用的现象越来越严重。在目前所使用的添加剂中，绝大多数为人工化学合成添加剂，过量的食用此类人工合成添加剂可以引发人体急性或慢性中毒，从而严重危害人们的健康。葡萄酒以新鲜葡萄或葡萄汁为原料，经部分或完全发酵而成，在适量饮用的条件下，能够防治各种疾病，增强人体健康，是被公认的对人体有益的健康酒精饮品[2]。国标GB15037—2006《葡萄酒》规定葡萄酒中不得添加合成着色剂、甜味素、香精、增稠剂。因此，建立一种快速测定葡萄酒中的各种添加剂的方法，对于食品行业的卫生监管具有重要意义。

目前，添加剂的测定方法主要有国家标准[3-7]和高效液相色谱的方法[8-15]。国标需要使用不同的仪器进行测定，而且只能单一的检测1种或2～3种添加剂，对待同一种样品还需要经过不同的前处理的方法，耗时耗力，还增加了成本。而对于同时测定葡萄酒中这5种添加剂的高效液相色谱方法在国内报道的也不多。采用高效液相的方法，前处理简单，操作便捷，能够在20 min内同时测定出葡萄酒中的3种防腐剂和2种甜味剂，建立葡萄酒中常用防腐剂和甜味剂的快速测定的技术，能够在大多实验室得以普及。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试剂

甲醇（色谱纯）：德国Merck公司；乙酸铵（分析纯）、乙酸锌（分析纯）、亚铁氰化钾（分析纯）、NaOH（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；实验用水为超纯水；苯甲酸、山梨酸、安赛蜜（乙酰磺胺酸钾）：国家标准物质研究中心；脱氢乙酸（纯度≥99.9%）、阿斯巴甜（天门冬酰苯丙氨酸甲酯）（纯度≥99%）：美国色谱科公司。

1.1.2 溶液的配制

220 g/L乙酸锌溶液：称取220 g乙酸锌于烧杯中，加入800 mL纯水溶解，最后纯水定容至1 L。

106 g/L亚铁氰化钾溶液：称取106 g亚铁氰化钾于烧杯中，加入800 mL纯水溶解，最后纯水定容至1 L。

40 g/L NaOH溶液：称取40 g NaOH于烧杯中，加入800 mL纯水溶解，最后加水定容至1 L。

脱氢乙酸标准储备液：称取0.05 g脱氢乙酸于5 mL容量瓶中，用甲醇/水（5∶95）定容至刻度，得质量浓度为1.0 mg/mL的脱氢乙酸标准储备液，置于4 ℃冰箱中保存。

阿斯巴甜标准储备液：称取0.1 g阿斯巴甜于10 mL容量瓶中，用甲醇/水（50∶50）定容至刻度，得质量浓度为1.0 mg/mL的阿斯巴甜标准储备液，置于4 ℃冰箱中保存。

苯甲酸标准储备液（GBW（E）100006）、山梨酸标准储备液（GBW（E）100007）、安赛蜜标准储备液（GBW（E）1000171）质量浓度均为1.0 mg/mL，置于4 ℃冰箱中保存。

1.2 仪器与设备

Waters e-2695高效液相色谱仪：美国Waters公司，配备二级管阵列（diode array，DA）紫外可见光检测器；AWJ2b-10-U型艾科浦U系列纯化水机：渝钦实业上海有限公司；0.22 μm水相过滤器：上海安普科学仪器有限公司；HH-S型电热恒温水浴锅：江苏省医疗器械厂。

1.3 方法

1.3.1 样品的处理方法

称取约5 g混合均匀的葡萄酒样品（精确至0.001 g）于蒸发皿中，沸水浴加热去除乙醇，然后用纯水少量多次地转移到50 mL比色管中，加入1 mL乙酸锌溶液与1 mL亚铁氰化钾溶液沉淀蛋白，用NaOH调节pH值至中性，加水定容并混匀。将样品转移入离心管中以3 000 r/min 离心5 min，取上清液过0.45 μm水相滤膜后上机测定。

1.3.2 色谱的条件

色谱柱：Sun FireTMC18色谱柱（4.6mm×250mm，5 μm）；紫外检测波长：230 nm、209 nm；柱温：25 ℃；流动相：甲醇/乙酸铵（0.02 mol/L）溶液组成，流速为1.0 mL/min，进样量为20 μL。

梯度洗脱程序：0～10 min，甲醇8%～40%；10～12 min，甲醇40%～60%；12～14 min，甲醇60%～8%；14～20 min，甲醇8%。

1.3.3 混合标准使用液的配制

分别准确吸取质量浓度均为1.0 mg/mL苯甲酸、山梨酸、安赛蜜、脱氢乙酸标准储备溶液1.00 μL、5.00 μL、10.00 μL、20.00 μL、50.00 μL于1 mL上样瓶中，再准确加入质量浓度为1.0 mg/mL阿斯巴甜标准储备溶液5.00 μL、25.00 μL、50.00 μL、100.00 μL、250.00 μL，各加水定容至1 mL得到含苯甲酸、山梨酸、安赛蜜、脱氢乙酸标准质量浓度为1.00 μg/mL、5.00 μg/mL、10.00 μg/mL、20.00 μg/mL、50.00 μg/mL，阿斯巴甜标准质量浓度为5.00 μg/mL、25.00 μg/mL、50.00 μg/mL、100.00 μg/mL、250.00 μg/mL的混合标准质量浓度。

1.3.4 样品的测定

以自动进样器取样品处理液20 μL进样，按高效液相色谱条件分析，以保留时间定性，根据外标法以峰面积定量。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

采用二极管阵列检测器对5种添加剂在190～400 nm之间进行三维光谱扫描，安赛蜜、苯甲酸、脱氢乙酸、山梨酸、阿斯巴甜的最大吸收波长分别在226 nm、223 nm、229 nm、252 nm、208 nm处。经过反复试验，综合考虑到各组分的灵敏度、基体干扰等因素，最终选定安赛蜜、苯甲酸、脱氢乙酸、山梨酸的检测波长为230 nm，阿斯巴甜的检测波长为209 nm，在此波长条件下，5种食品添加剂分离度效果好、基线稳定、灵敏度高、稳定性好。

2.2 流动相的选择

图1 安赛蜜、苯甲酸、脱氢乙酸、山梨酸(A)及阿斯巴甜(B)混合标准色谱图Fig.1 Standard chromatogram of acesulfame,benzoic acid,dehydroacetic acid,sorbic acid(A)and aspartame(B)

以甲醇-乙酸铵（8∶92）的流动相进行等度洗脱，发现5种添加剂在色谱柱上保留时间比较集中，脱氢乙酸和阿斯巴甜发生重合，不能完全分离。于是又选择了甲醇/乙酸铵（15∶85）、甲醇/乙酸铵（39∶61）2种流动相，发现随着甲醇比例的增大，几个物质在色谱柱上的保留时间均缩短，其中安赛蜜、苯甲酸和山梨酸在色谱柱上保留时间相对稳定，而阿斯巴甜和脱氢乙酸的保留时间改变的相对比较大，并且仍然重合在一起。经过反复的试验，最终确定了梯度洗脱程序：0～10 min，甲醇8%～40%；10～12 min，甲醇40%～60%；12～14 min，甲醇60%～8%；14～20 min，甲醇8%。在此条件下，5种物质能够很好地分开，峰型好，安赛蜜、苯甲酸、脱氢乙酸、山梨酸色谱图见图1A，阿斯巴甜色谱图见图1B。

2.3 线性范围，检出限和定量限

按实验方法对混合标准溶液系列进行测定，以峰面积对质量浓度进行线性回归，绘制标准曲线。回归方程及相关系数见表1。由表1可以看出，5种物质在这种分离条件下，相关系数均＞0.999 0。根据国际理论和应用化学联合会（international union of pure and applied chemistry，IUPAC）规定的3倍噪音为样品的检出限，本方法5种物质的检出限在0.3～1.5 mg/L之间。

表1 5种物质的线性回归方程、相关系数Table 1 Regression equation and correlation of 5 components

2.4 样品加标回收率和精密度试验

表2 5种物质的回收率和精密度试验结果(n=6)Table 2 Results of the recovery rate and accuracy tests of 5 components(n=6)

对葡萄酒样品进行低、中、高3水平加标回收试验，每个添加水平取6个平行样，按照试验方法对样品进行前处理，计算平均加标回收率和精密度。结果如表2所示。由表2可知，5种物质的加标回收率在87.3%～110.0%之间，测定结果的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为0.5%～3.6%，说明实验的准确度和精密度较高，准确度和精密度符合实际样品的检测要求。

2.5 实际样品的测定

按该实验方法对市售4种葡萄酒样品进行测定，结果均未检出这5种添加剂。

3 结论

本研究建立了高效液相色谱法同时测定葡萄酒中安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸和阿斯巴甜5种添加剂的分析条件，最终在230 nm和209 nm的紫外检测波长下，经过1.0 mL/min甲醇和乙酸铵（0.02 mol/L）溶液的梯度淋洗，5种添加剂得到的很好的分离。结果表明，该方法加标回收率87.3%～110.0%，相对偏差为0.5%～3.6%，该方法灵敏度高、精密度好、准确度高，符合检测要求。同时，操作简单便捷，5种添加剂在20 min内就能够完全分离，达到日常测定样品的要求。

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