胎儿视网膜色素上皮细胞的原代培养和体外增殖能力的测定

袁松涛 薛志刚 林卿 刘庆淮 范国平

年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration,AMD）是引起50岁以上人群不可逆致盲眼病的首位病因[1]，全球大约有3～5千万患者。根据脉络膜新生血管形成或黄斑区萎缩，AMD可分为干性和湿性两种类型。目前对于湿性AMD临床利用Avastin、Lucentis以及光动力治疗可以有效控制疾病的进展，但是在白人中湿性AMD患者仅仅占患者的10﹪～15﹪，而干性AMD患者占到85﹪～90﹪。中国人AMD的研究初步显示中国人中干性AMD患者比例也很高[2-3]。目前临床上没有任何有效的治疗方法可以控制干性AMD的发生发展。鉴于干性AMD病理学上表现为黄斑区视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE）的变性和退化(degeneration)，因此RPE细胞移植始终被认为是治疗的研究方向，移植的RPE细胞可以替代退化的细胞，相关的研究也证实RPE细胞移植可以保持或恢复患者的视力[4]。目前有多种细胞被用于实验研究，包括人类胚胎干细胞（hESCs）或诱导性多功能干细胞（hiPSCs）分化而成的RPE细胞、自体RPE转位移植、自体虹膜色素上皮细胞（iris pigment epithelium,IPE），以及胎儿来源RPE（fetal RPE,fRPE）。多功能干细胞来源的RPE在移植中展现出了非凡的前景，但是还存在潜在的形成畸胎瘤的风险和低分化率；患者自体RPE转位移植手术复杂，存在PVR严重并发症，AMD复发的问题；IPE对某些视网膜变性模型具有治疗作用[5]，但是对IPE和RPE的表达谱研究表明IPE缺乏视紫红质循环中的某些关键酶，并不能完全替代RPE的生理功能[6]。fRPE的移植研究也很早就有开展，具有免疫原性低、易于同宿主视网膜整合、完全的RPE功能等特点。在这里笔者描述了fRPE的原代培养，鉴定，以及促体外增殖的研究。本研究希望为AMD的治疗提供丰富的胎儿RPE细胞来源。

材料及方法

一、fRPE细胞原代培养

本研究的所有工作均符合赫尔辛基宣言，并通过了伦理委员会评审。胎儿RPE细胞的培养基使用阿尔法基础培养基（Minimum Essential Medium Eagle Alpha Modification，Sigma-Aldrich®）为基液并配以10﹪热灭活的胎牛血清(heated inactivated FBS，Thermo Scientific No:SH30071.03IH)，2mmol/L L-谷 氨酸(L-glutamine，Gibco®),1X非必需氨基酸（1X Non essential amino acid，Gibco®），1﹪ N1补充剂（N1 supplements，Sigma-Aldrich®），0.25 mg/ml牛磺酸（Taurine，Sigma-Aldrich®），0.013 μg/L 三碘甲状腺氨酸（Triiodo-thyronine，Sigma-Aldrich®），以 及1:100青霉素/链霉素(Penicillin/Streptomycin,Gibco®)和20 μg/L 氢羟肾上腺皮质素（Hydrocortisone，Sigma-Aldrich®）。

原代fRPE来源于流产胎儿眼睛，将胎儿眼睛用抗生素浸泡后，移入PBS溶液，剪除角膜，去除虹膜和晶状体，轻轻挤出神经视网膜，可以看到眼球壁内侧的一层黑色组织就是RPE。在解剖显微镜下，用镊子小心撕下这一层色素膜，使其与脉络膜分离开，剩余的半透明脉络膜组织中有粗大的血管，揭下的RPE呈现小片状单层细胞。将分离的RPE用0.25﹪胰蛋白酶（Gibco®）溶液消化处理后解离成单细胞悬液，加入培养基终止消化反应。将RPE悬液种植于附有基质胶的6孔培养板中。

二、fRPE传代

fRPE的培养液每2 d需更换1次，待细胞生长至融合状态可以传代。将fRPE细胞培养基抽离后，用PBS溶液清洗细胞。将细胞浸于0.25﹪的胰蛋白酶溶液中处理15min。待细胞与组织板分离后加入培养基终止反应，用微量移液管反复吹打细胞结块直至细胞结块消失。179×g离心5min后，用培液重悬细胞。根据不同组织板的培养面积，将适量的细胞悬液接种于附有基质胶的培养板中。

三、免疫荧光染色对fRPE的鉴定

将RPE细胞分离后接种于铺有基质胶的盖玻片上。用1×PBS清洗后，将RPE细胞用4﹪多聚甲醛固定20～30min后，用1×PBS漂洗3次。用0.4﹪的Triton X-100对细胞通透化处理20min，用1×PBS漂洗3次。1﹪的牛血清白蛋白（BSA）封闭1h后加入一抗。本实验中将用到anti-ZO1以及anti-RPE65作为鉴定RPE特性的抗体。温室孵育1h后，用1×PBS漂洗3次并加入二抗避光孵育1h。用1×PBS漂洗3次后加入H33342染核5min。用PBS漂洗多余染核染料后用5μl封片剂封片。

四、二芳基脲衍生物WS3对fRPE增殖的影响

以二甲基亚砜（DMSO）溶解WS3(Xcess Biosciences,Inc)，WS3的工作浓度为25 nmol/L。将P2代fRPE细胞分3组，别培养在fPRE培养液，fRPE培养液添加WS3,以及加入等体积DMSO的fRPE培养基。培养基每天更换以保证RPE细胞获得持续的WS3及DMSO的接触。持续5 d用上文所述胰蛋白酶处理方式收集细胞，用培液重悬细胞后，将10μl细胞悬液滴入细胞计数板中计数。

五、统计学分析方法

采用SPSS 21.0统计软件进行统计分析，对fRPE细胞增殖率采用单因素方差分析，LSD法进行两两比较，以P < 0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、细胞培养和传代

不同胎儿来源的fRPE细胞并未在原代培养中展现出不同。刚接种贴壁后第1天的fPRE可以看到明显的色素，但是色素已经开始脱失（图1a）。fRPE生长迅速，表现出极强的体外增殖能力，第3天细胞就生长到很高的密度，细胞中色素已经大部分消失，细胞呈现梭型（图1b）。第10天细胞生长至碰壁状态，进入静止期，细胞密度不再增加。此时所有细胞展现出了RPE细胞铺路石样的典型形态，仍有部分细胞存在色素（图1c）。如果不传代而继续培养，3周后fRPE开始合成色素颗粒，细胞内色素开始显著增加（图1d）。传代后fRPE细胞则再次失去典型形态，色素完全脱失，直至细胞生长融合后3周后又再次开始合成色素。一般的fRPE可持续传至4代左右，第3代开始的RPE较前2代生长速度明显减缓（表1），有些细胞会展现出衰老的形态。

表1 初始细胞数及传代之后10d 细胞数

二、WS3对fRPE细胞体外增殖的影响

有研究表明作为小分子化合物WS3[7]可以促进fRPE的体外增殖。本实验探讨了WS3对fRPE体外增殖的影响，三组fRPE各时间点的细胞数比较结果见表2。因三组细胞的初始接种数量不一致，因此用细胞增殖率进行统计检验，结果显示：培养液中加入DMSO和WS3对fRPE增殖率的影响均有统计学差异（P < 0.05,n=3），各组细胞的生长曲线见（图2）。从传代后第4天开始，接触WS3的fRPE表现轻度增强的生长趋势，但是并未表现出与文献报道中那样明显的促增殖作用[7]。

图1 倒置显微镜明场下的fRPE细胞（×100）

三、体外培养的fRPE分子标志物表达的检测

体外培养的fRPE通过抗体免疫荧光染色，可以检测到各种RPE特异表达的分子标志物：ZO-1、RPE65 等（图 3）。

讨 论

fRPE的临床研究也早有报道［8-9］，但是始终没有得到临床眼科的广泛接受，除了当初研究的设备、技术条件的限制外，其中一个重要的原因就是伦理问题。胎儿组织临床应用始终是敏感的伦理问题，包括胚胎干细胞同样如此。本研究显示，fRPE具有极其巨大的体外增殖能力，一只胎儿眼的RPE细胞在P0代体外就能扩增得到1千万个RPE细胞。如果按照胚胎干细胞来源RPE临床实验的报道［10］，每个干性AMD患者需要移植5万个细胞来计算，一个胎儿眼的RPE细胞能够提供数百名AMD患者接受RPE细胞移植治疗。能够极大的减轻对fRPE临床应用的伦理争论，同时也彻底解决移植手术供体缺乏的问题，而且在安全性上也明显优于干细胞来源的RPE细胞。在fRPE培养的过程中也只是使用了一般的培养试剂，并没有特别昂贵的细胞因子，这样避免了患者接受移植手术需要支付高昂的治疗费，这些都为fRPE的临床应用提供了非常有利的条件。

fRPE原代培养中撕下RPE细胞片层是关键，需要精细的显微操作。这一操作可以获得足够量的细胞，同时保证细胞的纯度，避免其他细胞的污染。fRPE细胞原代培养还需要注意组织的新鲜，胎儿眼一旦离体时间过长，组织开始溶解，则不能获得比较完整的RPE组织片层，只能零散地刮下散在的黑色素颗粒，既容易混杂有其他细胞，获取的细胞也不易贴壁。

图3 荧光共聚焦显微镜下观察体外培养的fRPE分子标志物形态（抗体免疫荧光染色×600））

文献报道了WS3可以促进RPE细胞的体外增殖[7]，笔者观察到的促增殖作用并没有文献报道的具有明显促增殖作用，仅仅在融合后有轻微的促进细胞生长的趋势，对传代的代数影响也同样不甚明显。可能的原因是胎儿个体间的差异、细胞传代时机不尽相同。此外，WS3添加的fRPE在指数生长期阶段在形态上更接近于纤维细胞，和常规培养的RPE细胞有明显区别。WS3的促增殖作用对fRPE的生理功能是否有影响，是否适合用于Ex Vivo治疗的体外培养，还有待后续实验的进一步证明。

本实验结果显示了fRPE巨大的体外增殖能力，在其原代体外培养过程中可以表达多种RPE特有的功能性标志物，为需要RPE移植的AMD患者提供了一种丰富的细胞来源。

1 Holz FG,Pauleikhoff D,Spaide RF,et al.Alan.Age-Related Macular Degeneration[M].Springer,Second Edition,2013,3-7.

2 Stein JD,Vanderbeek BL,Talwar N,et al.Rates of nonexudative and exudative AMD among Asian American ethnic groups[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2011,52(9):6842-6848.

3 Yang K,Liang YB,Gao LQ,et al.20.Prevalence of agerelated macular degeneration in a rural Chinese population:the Handan Eye Study[J].Ophthalmology,2011,118(7):1395-1401.

4 Anton M.Kolomeyer,Ilene K.et al.Characterization of conditioned media collected from cultured adult versus fetal retinal pigment epithelial cells[J].Inves Ophthalmol Vis Sci,2011,52(8): 5973-5986.

5 Rowland TJ,Buchholz DE,Clegg DO.Pluripotent Human Stem Cells for the Treatment of Retinal Disease[J].J Cell Physiol,2012,227(2): 457-466.

6 Cai H,Shin MC,Tezel TH,et al.Use of iris pigment epithelium to replace retinal pigment epithelium in agerelated macular degeneration: A gene expression analysis[J].Arch Ophthalmol,2006,124(9): 1276-1285.

7 Swoboda JG,Elliott J,Deshmukh V,et al.Small Molecule Mediated Proliferation of Primary Retinal Pigment Epithelial Cells[J].ACS Chem Biol,2013,8(5):1407-1411.

8 Weisz JM,Humayun MS,De Juan E,Jr.,Del Cerro M,Sunness JS,et al.Allogenic fetal retinal pigment epithelial cell transplant in a patient with geographic atrophy[J].Retina,1999,19(6): 540-545.

9 Algvere PV,Gouras P,Dafgard Kopp E.Long-term outcome of RPE allografts in non-immunosuppressed patients with AMD[J].Eur J Ophthalmol,1999,9(3):217-230.

10 Schwartz SD,Hubschman JP,Heilwell G,Franco-Cardenas V,Pan CK,et al.Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report[J].Lancet,2012,379(9817): 713-720.