MicroRNA-34a靶向SIRT1参与阿霉素诱导的心肌细胞凋亡*

唐春梅， 张 铭， 胡志琴， 朱杰宁， 符永恒， 张梦珍， 林秋雄， 邓春玉， 谭虹虹， 吴书林， 单志新, △

(1南方医科大学，广东 广州 510515； 2广东省人民医院/广东省医学科学院，广东 广州 510080)

·论 著·

MicroRNA-34a靶向SIRT1参与阿霉素诱导的心肌细胞凋亡*

唐春梅1， 张 铭2， 胡志琴1， 朱杰宁2， 符永恒2， 张梦珍2， 林秋雄2， 邓春玉2， 谭虹虹2， 吴书林2， 单志新1, 2 △

(1南方医科大学，广东 广州 510515；2广东省人民医院/广东省医学科学院，广东 广州 510080)

目的： 研究微小RNA-34a(microRNA-34a，miR-34a)在阿霉素诱导的心肌细胞凋亡中的作用及其作用靶基因。方法: 建立阿霉素(doxorubicin, Dox)诱导的大鼠H9c2心肌细胞凋亡模型；TUNEL染色观察H9c2细胞凋亡;双萤光素酶报告实验检测miR-34a与潜在靶基因沉默信息调节因子1 (silent information regulator 1,SIRT1) 3’端非翻译区(3’-untranslated region, 3’UTR)的结合作用；实时荧光定量PCR检测miR-34a和SIRT1 mRNA表达水平，Western blot检测SIRT1和凋亡相关蛋白表达水平。结果: 阿霉素处理H9c2细胞之后，细胞发生凋亡，miR-34a的表达显著增强；双萤光素酶报告实验提示miR-34a与SIRT1 3’UTR可相互作用，并证实miR-34a可在转录后水平抑制SIRT1的表达，SIRT1蛋白水平在阿霉素处理的心肌细胞中显著下调；过表达miR-34a及沉默SIRT1均能一致性抑制Bcl-2表达，促进Bax和p66shc的表达，而过表达SIRT1能有效抑制阿霉素诱导的H9c2细胞凋亡。结论:SIRT1是miR-34a的靶基因，并介导了miR-34a在阿霉素诱导的心肌细胞凋亡中的作用。

阿霉素； 心脏毒性； 微小RNA-34a； 沉默信息调节因子1； H9c2细胞； 细胞凋亡

阿霉素(doxorubicin，Dox)是临床广泛应用的抗生素类广谱抗肿瘤药，它通过嵌入基因组DNA而抑制核酸的合成[1]。阿霉素具有强烈的细胞毒性作用，包括能引起严重的心脏毒性，因而对其临床应用产生了剂量限制[2]，而阿霉素诱导心肌细胞凋亡是其心脏毒性的重要机制[3-4]。

微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是一类小的非编码RNA，它能特异地与靶基因mRNA的3’端非翻译区(3’-untranslated region, 3’-UTR)序列相互识别，在转录或转录后水平负调控基因表达[5]。研究表明，microRNA 参与调控包括细胞增殖、分化、凋亡等各种生物进程[6]，由于其在心血管功能、疾病中的重要调控作用，逐渐成为心血管疾病的潜在生物标志和治疗靶点[7-8]。心肌细胞凋亡是导致心脏功能损伤的重要因素，已有报道显示多种microRNA参与心肌细胞凋亡的过程。过表达miR-125b能有效抑制缺血再灌注以及脓毒症导致的小鼠心肌细胞凋亡，从而减轻小鼠心功能损伤[9]。miR-24能抑制心肌细胞缺血缺氧条件下的凋亡水平，进而改善心梗后心功能[10]。而过表达miR-200a能有效抑制低氧诱导的氧化应激和心肌细胞凋亡，从而发挥心脏保护作用[11]。

miR-34a参与细胞凋亡、细胞周期阻滞和细胞衰老等过程[12-13]。miR-34a能促进心梗大鼠的心肌细胞凋亡，过表达miR-34a可明显增加乳大鼠心肌细胞的凋亡[14]。本文将主要研究miR-34a在阿霉素诱导的大鼠H9c2细胞凋亡中的表达及其参与阿霉素诱导心肌细胞凋亡过程的分子机制。

材 料 和 方 法

1 主要试剂

限制性内切酶XhoI和EcoR I、转染试剂Lipofectamine 2000、TRIzol、逆转录试剂盒、4×SDS loa-ding buffer(Invitrogen)；2×SYBR Green Mix、RNAase free water(TaKaRa)；miR-34a mimic、沉默信息调节因子1 (silent information regulator 1，SIRT1)siRNA(广州锐博)；BCA蛋白定量试剂盒(Thermo)；SDS-PAGE凝胶配置试剂盒、TUNEL试剂盒(碧云天)；抗GAPDH、p66shc和Bax抗体(Protein Technology)；抗Bcl-2抗体(Abcam)；抗SIRT1 抗体(Sigma)；蛋白marker(Fermentas)； PVDF膜(Whatman)； ECL发光液(Bioword)；DMEM/F12细胞培养基(HyClone)；特级澳洲胎牛血清(Gibco)。其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。

2 主要方法

2.1 大鼠心肌细胞(H9c2细胞)处理 将大鼠H9c2细胞(ATCC)稳定培养，分别给予不同浓度(0、1、2、4、5 μmol/L)阿霉素处理24 h，诱导心肌细胞凋亡；分别将100 nmol/L scramble对照、miR-34a mimic和SIRT1 siRNA转染H9c2细胞，24 h后结束实验；分别将空载体质粒(pcDNA3)和SIRT1质粒(pcDNA3-SIRT1)转染H9c2细胞，之后给予或不给予阿霉素处理24 h。

2.2 TUNEL 染色 将H9c2细胞铺在预先放置盖玻片的6孔板中稳定生长，给予不同处理之后，吸掉培养基，用PBS漂洗2次，加入1 mL 4 %的多聚甲醛溶液固定，用PBS漂洗3次，加入新配置的100 μL TUNEL检测液，37 ℃避光孵育60 min。用PBS漂洗3次，加入含DAPI的抗荧光猝灭封片液封片后荧光显微镜下观察。

2.3 实时荧光定量PCR检测SIRT1以及miR-34a的表达 用TRIzol试剂提取心肌细胞总RNA。取2.0 μg总RNA，加入5×的逆转录试剂4 μL(逆转录试剂盒)，用oligo(dT)15和random primers逆转录出cDNA用于检测SIRT1的mRNA水平。取1.0 μg总RNA，用miR-34a特异的RT引物(5’-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGAT-ACGACACAACCAG-3’)逆转录出cDNA用于检测miR-34a水平。分别用GAPDH和U6作为检测SIRT1和miR-34a表达水平的内参照。在ViiATM7 Real-Time PCR System(Applied Biosystems)上进行PCR反应和结果分析。以2-ΔΔCt法计算SIRT1和miR-34a的相对表达水平。所用PCR引物序列见表1。

表1 RT-qPCR的引物序列

F: forward; R: reverse.

2.4 Western blot法检测蛋白水平 收集处理后的心肌细胞，加入RIPA蛋白裂解液，冰上裂解，于4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，取上清进行蛋白定量后分装，加入4×上样缓冲液，100 ℃加热10 min使蛋白变性，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。用聚偏二氟乙烯(PVDF)膜转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，分别用相应的SIRT1 (1∶1 000)、p66shc(1∶1 000)、Bcl-2(1∶200)和Bax(1∶1 000)Ⅰ抗4 ℃孵育过夜。TBST洗膜后，加Ⅱ抗(1∶5 000或1∶1 000)4 ℃孵育2 h。ECL发光试剂盒显影，以GAPDH(1∶5 000)为内参照，扫描灰度值并分析蛋白表达相对含量。

2.5 双萤光素酶报告实验验证miR-34a与SIRT1 3’UTR的结合作用 参照我们已报道方法[15]分别构建包含miR-34a潜在结合序列的SIRT1 3’UTR重组萤光素酶报告质粒pGL3-SIRT1-746-752和pGL3-SIRT1-1236-1242，以及包含结合序列突变的重组质粒pGL3-SIRT1-746-752-MUT和pGL3-SIRT1-1236-1242-MUT。将HEK293细胞(细胞密度约为每孔1×105)转染200 ng重组萤光素酶报告质粒、100 nmol/L miR-34a mimic以及10 ng pRL-TK(表达海肾萤光素酶的内参照质粒)。转染后24 h，测定萤火虫萤光素酶(firefly luciferase，FL)及海肾萤光素酶(Renillaluciferase，RL)活性，两者比值(FL/RL)变化可反映miR-34a与SIRT1 3’UTR结合的能力。

3 统计学处理

用SPSS 21.0统计软件进行分析。数据均采用均数±标准误(mean±SEM)表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，并用SNK-q检验进行各组间的两两比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 miR-34a在阿霉素处理的H9c2细胞中表达增强

TUNEL染色结果显示，分别用1、2、4、5 μmol/L阿霉素处理H9c2细胞24 h后，随着阿霉素浓度增加，心肌细胞凋亡率也明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。RT-qPCR结果显示，与空白组相比，阿霉素处理的H9c2细胞中miR-34a的表达显著增强，差异有统计学意义(P<0.05)。以上实验结果显示，阿霉素能有效诱导心肌细胞凋亡，浓度4～5 μmol/L时效果明显，为后续实验选用4 μmol/L浓度提供了实验依据；且阿霉素能显著上调miR-34a的表达，见图1。

Figure 1.miR-34a was up-regulated in Dox-treated H9c2 cells. A: the apoptotic H9c2 cells was detected by TUNEL assay. The scale bar=100 μm. B: determination of the miR-34a expression in the H9c2 cells by RT-qPCR. Mean±SEM. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs 0 μmol/L group.

2 miR-34a作用靶基因SIRT1的鉴定

基于miRDB数据库(www.mirdb.org)以及TargetScan(www.targetscan.org)的序列分析提示，SIRT1 3’UTR的746～752和1 236～1 242碱基可能是miR-34a的结合位点。双萤光素酶报告基因检测结果显示，转染pGL3-SIRT1-746-752和pGL3-SIRT1-1236-1242质粒的HEK293细胞，其萤光素酶活性分别较对照组下降约50%(P<0.01)和 35%(P<0.05)；而转染含突变结合序列的质粒则对萤光素酶活性无显著影响，说明miR-34a能特异结合到SIRT1 3’UTR的746～752和1 236～1 242位点，并抑制结合位点上游的萤火虫萤光素酶的表达。RT-qPCR 和Western blot法检测结果显示，SIRT1在阿霉素诱导凋亡的H9c2细胞中表达显著降低；同时证实，凋亡相关的Bax在阿霉素诱导凋亡的H9c2细胞中表达显著增强，而Bcl-2表达显著降低。转染miR-34a mimic不影响H9c2细胞中SIRT1的 mRNA表达，但可显著抑制H9c2细胞中SIRT1的蛋白表达，提示miR-34a可在转录后水平调控SIRT1的表达，见图2。

Figure 2.Identification of SIRT1 as a target of miR-34a in the H9c2 cells exposed to Dox. A: dual luciferase assay. Mean±SEM. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs pGL3-promoter group. B: the mRNA expression of SIRT1 in the H9c2 cells exposed to Dox. Mean±SEM. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs 0 μmol/L group. C: the protein expression of Bax, Bcl-2 and SIRT1 in the H9c2 cells exposed to Dox. Mean±SEM. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs 0 μmol/L group. D: the expression of SIRT1 in miR-34a-modified H9c2 cells. Mean±SEM. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs scramble control group.

3 SIRT1介导miR-34a的促H9c2细胞凋亡作用

为了鉴定过表达miR-34a与抑制SIRT1对心肌细胞凋亡的影响，分别将100 nmol/L miR-34a mimic和SIRT1 siRNA转染入H9c2细胞中；另外将空载体质粒(pcDNA3)和SIRT1质粒(pcDNA3-SIRT1)转染入阿霉素诱导的H9c2细胞中，验证过表达SIRT1对阿霉素的诱导H9c2细胞凋亡的影响。Western blot实验结果显示，miR-34a mimic和SIRT1 siRNA能一致性地抑制H9c2细胞中SIRT1表达，SIRT1底物p66shc蛋白水平升高；同时Bax蛋白表达增强而Bcl-2蛋白表达降低。TUNEL染色结果显示，过表达SIRT1能有效抑制阿霉素诱导的H9c2细胞凋亡。Western blot实验结果显示，阿霉素诱导的H9c2细胞中Bax和p66shc表达增强，Bcl-2表达减弱，而过表达SIRT1能显著降低阿霉素处理的H9c2细胞中Bax和p66shc表达，增加Bcl-2表达，见图3。

Figure 3.SIRT1 mediated the pro-apoptotic effect of miR-34a in Dox-treated H9c2 cells. A: the protein expression of Bax, Bcl-2, p66shc and SIRT1 in H9c2 cells treated with miR-34a or SIRT1 siRNA was determined by Western blot. Mean±SEM. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs scramble group. B: the apoptosis of H9c2 cells was detected by TUNEL assay. The scale bar=100 μm. C: the protein expression of Bax, Bcl-2, p66shc and SIRT1 in H9c2 cells treated with pcDNA3, pcDNA3+Dox or pcDNA3-SIRT1 (pcSIRT1)+Dox was determined by Western blot. Mean±SEM. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs pcDNA3 group; #P<0.05, ##P<0.01 vs pcDNA3+Dox group.

讨 论

近期研究发现，阿霉素主要是通过激活心肌氧化应激，促进活性氧蓄积等途径引起心肌细胞凋亡[16-17]。H9c2心肌细胞来源于胚胎BDIX大鼠心脏组织，这类细胞具有骨骼肌的功能，包括表达烟碱受体和产生特定肌肉的肌酸激酶同工酶[18]。已有研究证实，阿霉素可使H9c2细胞中活性氧累积并激活AMPK，进而导致p53发生磷酸化，最后导致细胞凋亡[19]；而在普通细胞和肿瘤细胞中，阿霉素还可以通过激活ERK/p53通路或者激活caspase-2，-3来诱导细胞凋亡[20-21]。

miR-34家族包括miR-34a、miR-34b和miR-34c，它们具有组织表达特异性，其中miR-34a主要在心、脑、肾、肺组织中高表达[22]。Ito等[23]首次报道了miR-34家族在心血管系统中的功能。研究发现，miR-34a通过负调控SIRT1来促进内皮细胞衰老[22]；在衰老小鼠主动脉中，高表达的miR-34a抑制SIRT1，从而促进主动脉平滑肌细胞的衰老及炎症因子的分泌[24]；小鼠心梗后，miR-34a可直接调控SIRT1、Bcl-2和cyclin D1的表达来抑制心脏修复[25]；Boon等[26]发现miR-34a在心梗小鼠心脏中高表达，而沉默miR-34a可减少细胞死亡，丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶1调节亚基10介导了miR-34a的促DNA损伤和心肌细胞凋亡及心肌收缩功能损伤作用。

本文中，我们证实miR-34a在阿霉素诱导凋亡的H9c2细胞中表达升高，这与既往关于小鼠静脉注射Dox可使心脏miR-34a表达增加的报道是相符的[27]。研究显示，抑制JNK和NF-κB信号通路可上调单核细胞RAW 264.7中miR-34a表达[28]，但目前Dox上调心肌细胞中miR-34a上调表达的机制还不清楚。

双萤光素酶报告基因实验提示miR-34a可与SIRT1 3’UTR特异性结合。通过检测miR-34a修饰的H9c2中SIRT1的表达证实miR-34a可在转录后水平抑制SIRT1表达。进一步的功能性研究表明，过表达miR-34a及沉默SIRT1均能一致性地促进H9c2细胞凋亡，而过表达SIRT1能有效抑制阿霉素诱导的H9c2细胞凋亡。因此，上述结果证实SIRT1是miR-34a的靶基因，并介导了miR-34a参与阿霉素诱导的H9c2细胞凋亡。而已有研究显示，白藜芦醇(SIRT1激动剂)正是通过激活SIRT1来减轻Dox诱导的心肌毒性[29]。我们的结果也证实Bcl-2也是miR-34a的靶基因，miR-34a能特异地抑制H9c2细胞中Bcl-2表达，这与以往报道一致[25]。

沉默信息调节因子2同源蛋白家族是一类保守的去乙酰化酶蛋白家族, 包括SIRT1～7，具有明显的分布特异性，其中SIRT1主要分布在细胞核中，细胞质和细胞膜上少量分布[30]。SIRT1在心血管疾病中的作用已被广泛关注和研究。压力负荷、饥饿、运动、急性局部缺血等均会导致心脏中SIRT1上调表达，而缺血再灌注损伤使其下调表达[31]。全身敲除SIRT1的小鼠，其心脏存在严重的发育缺陷[32]，特异性降低心脏中SIRT1水平会加重缺血再灌注导致的心肌损伤[33]。上述结果提示SIRT1具有非常重要的心肌保护作用。本文结果也表明，SIRT1在阿霉素诱导的凋亡H9c2细胞中表达降低，升高的miR-34a在转录后水平进一步抑制SIRT1表达，而过表达SIRT1可有效抑制阿霉素诱导的H9c2细胞凋亡。

p66shc是 shcA适配器分子的一种亚型，是一种氧化还原酶，能增强脂质过氧化介导线粒体死亡途径诱导的细胞凋亡[34]。既往研究显示，p66shc是SIRT1的作用靶点，SIRT1通过抑制p66shc减轻肝细胞的氧化应激和凋亡[35-36]。而在本文中，我们发现SIRT1过表达能显著降低H9c2细胞中p66shc表达，进而降低Bax，升高Bcl-2表达；miR-34a抑制H9c2细胞中SIRT1表达后，Bax表达升高，Bcl-2表达降低，促进细胞凋亡。

综上所述，本文证实miR-34a在阿霉素诱导凋亡的H9c2细胞中表达上调，通过双萤光素酶报告基因实验、靶基因表达和相应功能性实验证实SIRT1是miR-34a的作用靶基因，miR-34a/SIRT1/p66shc介导了阿霉素诱发的心肌细胞凋亡。在后续研究中，我们将在整体动物水平进一步明确miR-34a对SIRT1表达和阿霉素诱发心脏毒性的作用。

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(责任编辑： 陈妙玲， 罗 森)

MicroRNA-34a participates in doxorubicin-induced cardiomyocyte apoptosis via targetingSIRT1

TANG Chun-mei1, ZHANG Ming2, HU Zhi-qin1, ZHU Jie-ning2, FU Yong-heng2, ZHANG Meng-zhen2, LIN Qiu-xiong2, DENG Chun-yu2, TAN Hong-hong2, WU Shu-lin2, SHAN Zhi-xin1, 2

(1SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China;2GuangdongGeneralHospital,GuangdongAcademyofMedicalSciences,Guangzhou510080,China.E-mail:zhixinshan@aliyun.com)

AIM: To investigate the role of microRNA-34a (miR-34a) in doxorubicin (Dox)-induced cardiomyocyte apoptosis and the potential target gene. METHODS: The apoptotic model of H9c2 cells was established by Dox induction. The apoptotic H9c2 cells was detected by TUNEL assay. Dual luciferase reporter assay was performed to confirm the interaction between miR-34a and the 3’UTR of silent information regulator 1 (SIRT1). The expression of miR-34a and SIRT1 mRNA was determined by RT-qPCR, and the protein expression of SIRT1 and apoptosis-related proteins was detected by Western blot. RESULTS: Cell apoptosis and miR-34a was markedly increased in Dox-induced H9c2 cells. Dual luciferase reporter assay revealed that miR-34a interacted with the 3’UTR of SIRT1, and miR-34a was observed to inhibit SIRT1 expression at the post-transcriptional level. The protein expression of SIRT1 was markedly decreased in the apoptotic H9c2 cells. Moreover, miR-34a mimic, in parallel toSIRT1 siRNA, inhibited Bcl-2 expression but increased the expression of Bax and p66shc. Overexpression of SIRT1 significantly inhibited Dox-induced apoptosis in the H9c2 cells. CONCLUSION:SIRT1 is a target gene of miR-34a, and mediates the effect of miR-34a on Dox-induced cardiomyocyte apoptosis.

Doxorubicin; Cardiotoxicity; MicroRNA-34a; Silent information regulator 1; H9c2 cells; Apoptosis

1000- 4718(2017)03- 0385- 07

2016- 10- 11

2016- 12- 09

国家自然科学基金资助项目(No. 81270222； No. 81470439; No. 91649109)；广东省医学科学研究项目(No. 2014A030313635； No. 2013B022000083； No. A2015187)

△通讯作者 Tel: 020-83827812-51158； E-mail: zhixinshan@aliyun.com

R329.21

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.03.001