棕榈酸刺激的巨噬细胞对HepG2细胞侵袭和迁移的影响*

王 燕， 晏 勇， 钟 珊， 阮雄中， 陈压西， 赵 蕾

(重庆医科大学脂糖代谢性疾病重庆市重点实验室，脂质研究中心，重庆 400016)

棕榈酸刺激的巨噬细胞对HepG2细胞侵袭和迁移的影响*

王 燕， 晏 勇， 钟 珊， 阮雄中， 陈压西， 赵 蕾△

(重庆医科大学脂糖代谢性疾病重庆市重点实验室，脂质研究中心，重庆 400016)

目的： 研究棕榈酸刺激的巨噬细胞对肝癌细胞侵袭和迁移能力的影响,并进一步探讨其作用机制。方法: 应用棕榈酸(0.16 mmol/L)刺激人急性单核细胞白血病细胞系THP-1来源的巨噬细胞，并取其上清液处理HepG2细胞。细胞迁移实验检测巨噬细胞的迁移能力，侵袭实验和划痕实验分别观察HepG2细胞的纵向迁移能力和横向迁移能力；RT-qPCR检测巨噬细胞和HepG2细胞的炎症/趋化因子及HepG2细胞上皮-间充质转化标志蛋白(E-cadherin和N-cadherin) 的mRNA表达水平。结果: 棕榈酸促进了巨噬细胞迁移，显著上调巨噬细胞白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和单核细胞趋化蛋白1 (MCP-1)的mRNA表达；用棕榈酸刺激巨噬细胞的上清液处理HepG2细胞，其纵向迁移能力和横向迁移力明显强于未经棕榈酸处理组，且HepG2细胞的多种炎症因子和N-cadherin表达上调，E-cadherin表达下调。结论: 棕榈酸可以增强巨噬细胞的迁移能力，刺激巨噬细胞产生大量炎症因子/趋化因子，进一步通过旁分泌/内分泌作用于HepG2细胞，促进HepG2细胞的上皮-间充质转化，增强HepG2细胞的侵袭与迁移能力。

棕榈酸； HepG2细胞； 巨噬细胞； 炎症因子； 细胞侵袭； 细胞迁移

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一种常见的高致死率恶性肿瘤之一，是我国癌症死亡的第二大原因。影响肝癌患者预后的因素众多,但肿瘤的侵袭和转移是影响肝癌患者预后的最关键因素之一。近年研究提示肥胖及糖尿病患者的乳腺癌、前列腺癌、肝癌等发病率高于正常对照组[1]。因此欧洲癌症预防研究机构提出了避免超重/肥胖、积极减肥能预防肿瘤发生的观点[2]。

肥胖状态下，脂肪组织的脂肪水解增强，导致血清游离脂肪酸含量增加，尤其是饱和脂肪酸显著增加。16碳的饱和脂肪酸——棕榈酸(palmitate，PA)作为游离脂肪酸中最主要的饱和脂肪酸成分，是诱导机体产生胰岛素抵抗的主要因素之一[11]，但其对肿瘤的发生和转移的影响及作用机制尚不清楚[3]。研究已经证实：巨噬细胞浸润和炎症因子与肝癌的发生和转移密切相关[5]。因此本研究拟采用PA刺激THP-1来源的巨噬细胞，观察其对HepG2细胞的浸润迁移的影响并初步探讨其分子机制。

材 料 和 方 法

1 材料

人肝癌细胞株HepG2由重庆医科大学肝病研究所惠赠；人单核细胞株THP-1购自于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；Transwell 共培养体系购自Corning；胎牛血清、DMEM 培养基和1640培养基购自Gibco；PBS缓冲液、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、胰蛋白酶和青-链霉素购自上海生工生物工程股份有限公司；PA和佛波酯(phorbol myristate acetate，PMA)购自Sigma-Aldrich；RNAiso Plus、PrimeScript RT试剂盒和SYBR Premix Ex Taq Ⅱ购自TaKaRa；PCR 引物采用ABI Primer Express 软件设计，由北京华大基因公司合成。

2 方法

2.1 实时荧光定量PCR实验(RT-qPCR) 用RNAiso Plus按试剂说明书提取细胞总RNA。标化RNA 浓度，用逆转录试剂按20 μL体系混匀，瞬时离心后放于逆转录仪中，逆转录成cDNA。逆转录条件为37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。然后取2 μL cDNA以β-actin为内参照进行qPCR，反应体系为25 μL。扩增条件：95 ℃ 1 min; 95 ℃ 15 s， 55 ℃ 30 s， 72 ℃ 15 s，共39个循环。引物序列见表1。

2.2 巨噬细胞的迁移实验 将处于对数生长期的THP-1细胞，常规离心、去上清液后，加入含PMA(160 nmol/L)的完全培养基，调节细胞浓度至4×108/L，将300 μL细胞悬液滴至孔径大小为5 μm Transwell小室中，常规诱导THP-1细胞48 h，得到分化成熟的巨噬细胞。向各组巨噬细胞中加入300 μL的0.2% BSA培养基饥饿12 h；去掉小室内陈旧培养基，向实验组加入300 μL新鲜的含PA(0.16 mmol/L)的0.2% BSA培养基,对照组给与0.2% BSA培养基，置孵箱中培养24 h；取出Transwell小室，去除陈旧的培养基，用新鲜PBS洗涤细胞，用棉签擦去小室内面未迁移的细胞，再向每孔加入200 μL 4%多聚甲醛，室温下固定10 min；去掉多聚甲醛溶液，PBS洗涤细胞3次。将小室底面朝上，1%结晶紫染色30 min；显微镜观测THP-1巨噬细胞染色情况并拍照。

表1 引物序列

2.3 Transwell 侵袭实验分析肝癌细胞的纵向迁移能力 在Transwell上层小室(24 孔，直径5 μm)底部膜的下表面包被10 μL 纤维连接蛋白(40 mg/L)，4 ℃放置48 h；把50 μL Matrigel (用无血清DMEM 培养液1∶3 稀释)加入Transwell 嵌套内，37 ℃孵育30 min。将HepG2细胞用无血清培养液制成细胞悬液接种于Transwell 上室(每孔1×106细胞)，向HepG2细胞中加入300 μL的0.2%BSA培养基饥饿12 h。去掉小室内陈旧培养基，向各组细胞分别加入300 μL巨噬细胞上清液和PA(0.16 mmol/L)处理巨噬细胞后的上清液。置孵箱中培养24 h后取出小室，用棉签去除Transwell 上室内的基质胶，用5%多聚甲醛固定Transwell 上层小室膜下表层的侵袭细胞10 min 后，用1%结晶紫染色20 min，置于显微镜下拍照。实验结果通过ImageJ 软件分析。

2.4 划痕实验分析肝癌细胞的横向迁移能力 在铺满汇合度达95%的单层HepG2 细胞的Transwell(24孔板)小室内，用10 μL 移液枪尖端轻轻笔直划痕，PBS 缓冲液轻轻洗去脱落细胞，在无血清的共培养体系中，向24孔板内相应加入有PA处理和无PA处理的巨噬细胞的上清液，划痕后的HepG2细胞于37 ℃、5% CO2培养箱共培养，分别取培养0 h、24 h和48 h的细胞，观察细胞的迁移情况并用倒置显微镜拍照,测量共培养前后划痕的宽度，通过ImageJ 软件分析。

3 统计学处理

用SPSS 17.0 软件进行统计分析，数据均以均数±标准误(mean±SEM)表示。采用独立样品t检验对两样本进行比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 PA对THP-1来源巨噬细胞迁移的影响

用0.16 mmol/L PA处理THP-1来源的巨噬细胞24 h后，巨噬细胞的迁移数量较对照组显著增加(P<0.01)，见图1。

Figure 1.Palmitate promoted macrophage migration. Mean±SEM. n=3. **P<0.01 vs control group.

2 PA对THP-1来源巨噬细胞炎症因子和趋化因子表达的影响

用0.16 mmol/L PA处理THP-1来源的巨噬细胞并收集进行相应检测，处理后的巨噬细胞IL-1β、TNF-α和IL-6 的mRNA含量较对照组有升高(P<0.01)；同时，巨噬细胞的趋化因子 MCP-1的表达较对照组也明显增加(P<0.01)。这说明PA刺激能促进THP-1来源的巨噬细胞IL-1β、TNF-α、IL-6和MCP-1的表达，见图2。

Figure 2.Relative mRNA expression in the macrophages. Mean±SEM. n=4. **P<0.01 vs control group.

3 PA处理的巨噬细胞对HepG2细胞迁移和侵袭的影响

通过测量各组0 h、24 h和48 h 3个时点的HepG2细胞的相对迁移距离评估细胞划痕实验结果。结果显示，相比对照组，用PA刺激后的巨噬细胞上清液处理的HepG2细胞横向迁移能力显著提高，表明PA激活的巨噬细胞可显著促进HepG2细胞的横向迁移，见图3。

Transwell 侵袭实验结果显示：相比control组，实验组HepG2细胞的纵向迁移能力也有显著提高(P<0.05)，说明PA刺激下巨噬细胞上清液可显著促进HepG2细胞的纵向迁移，见图4。

4 PA处理的巨噬细胞对HepG2细胞相关因子表达的影响

用0.16 mmol/L PA刺激THP-1来源的巨噬细胞后的上清液处理HepG2细胞，并收集HepG2细胞进行相应检测。我们发现相比control组，实验组HepG2细胞IL-1β、TNF-α、IL-6和MCP-1 的mRNA表达升高(P<0.01)；另外我们还发现实验组HepG2的E-cadherin表达较control组明显降低(P<0.01)，而N-cadherin的表达较对照组明显升高(P<0.01)。以上结果提示，PA刺激巨噬细胞的上清液可显著促进HepG2细胞产生炎症/趋化因子，并能促进HepG2细胞间充质转化，见图5、6。

Figure 3.Migration assay of the HepG2 cells. Mean±SEM. n= 3. *P<0.05, **P<0.01 vs control group.

Figure 5.Relative mRNA expression in the HepG2 cells. Mean±SEM. n=4. **P<0.01 vs control group.

Figure 6.Relative mRNA expression of epithelial-mesenchymal transition markers in the HepG2 cells. Mean±SEM. n=4. **P<0.01 vs control group.

讨 论

肿瘤微环境是决定肿瘤细胞行为的主要影响因素，在肿瘤发生发展与转移复发中发挥重要作用[6]。炎症对肿瘤微环境的形成具有非常重要的作用，多种炎症介质都可以促进肿瘤细胞的上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，增强肿瘤细胞的迁移和侵袭能力[7-8]。肥胖状态下，脂肪组织巨噬细胞分泌大量炎症因子(如TNF-α、MCP-1、 IL-6和IL-1β)，使机体长期处于持续的、全身性的、低水平的炎症状态[4]。最新研究提示：肥胖可以增加肝细胞癌的发病率，降低患者生存率，但机制尚未完全揭示[9-10]。

PA是游离脂肪酸组成成分中含量最高、致炎能力强的一种饱和脂肪酸，常用于建立体外的胰岛素抵抗和炎症模型。PA是TLR4的天然内源性配体，当PA水平升高时，可以上调TLR4受体的表达和/或激活TLR4/NF-κB 信号通路[12-13]。本研究中，我们发现：棕榈酸刺激THP-1来源的巨噬细胞，能促进巨噬细胞的浸润，并使巨噬细胞产生大量炎症因子/趋化因子。许多上皮肿瘤细胞都具有EMT的能力，这一过程可由旁分泌/内分泌/自分泌的多种炎症因子(比如IL-1β、IL-6和TNF-α)所诱导[14]。我们的结果表明：用棕榈酸刺激巨噬细胞的上清液处理HepG2细胞，可促进HepG2细胞自身也产生大量炎症/趋化因子，进一步地放大了炎症效应。在炎症因子的作用下，HepG2细胞的浸润迁移能力显著增强。既往研究已经表明：IL-1β等炎症因子可通过NF-κB等途径，抑制上皮细胞黏附分子E-cadherin表达，促进肝癌细胞EMT，从而影响细胞的转移潜能[15]。本研究也证实：与对照组相比，经棕榈酸刺激巨噬细胞的上清液处理的HepG2细胞的E-cadherin表达下调，N-cadherin表达上调，提示HepG2的转移潜能得到了增强。

综上所述，本研究表明棕榈酸刺激作用下可以增加巨噬细胞的局部浸润，促进巨噬细胞产生大量炎症因子/趋化因子；进一步地巨噬细胞通过旁分泌/内分泌作用于HepG2细胞，促进HepG2细胞上皮间质转化，加重HepG2细胞的浸润与迁移。因此，本研究在细胞模型上初步探讨了高棕榈酸血症状态下，巨噬细胞促进HepG2细胞浸润转移的可能机制，为解读肥胖等伴代谢性疾病与肿瘤的复杂关系提供一定的实验依据和参考。

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(责任编辑： 陈妙玲， 罗 森)

Effects of palmitate-stimulated macrophages on invasion and migration of HepG2 cells

WANG Yan, YAN Yong, ZHONG Shan, RUAN Xiong-zhong, CHEN Ya-xi, ZHAO Lei

(CentreforLipidResearch,ChongqingKeyLaboratoryofLipidandGlucoseMetabolism,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China.E-mail:laleinlz@hotmail.com)

AIM: To investigate the impact of palmitate-stimulated macrophages on the invasion and migration of HepG2 cells and to explore the underlying mechanism. METHODS: Human acute monocytic leukemia cell line THP-1 were induced to macrophages by phorbol myristate acetate and were stimulated with palmitate (0.16 mmol/L). The culture supernatants were collected and used to incubate HepG2 cells. The effect of palmitate on migration of the macrophages was detected by Transwell chamber assay. The mRNA expression of target genes was measured by RT-qPCR. The invasion and migration of the HepG2 cells were assessed by invasion assay and scratch test. RESULTS: Palmitate promoted the migration of the macrophages and increased the mRNA levels of interleukin-1β (IL-1β), interleukin-6 (IL-6), tumor necrosis factor-α (TNF-α) and monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1) in the macrophages. The invasion and migration of the HepG2 cells incubated with conditioned media from palmitate-stimulated macrophages were greater than those of the HepG2 cells incubated with conditioned media from macrophages without palmitate. The media of palmitate-stimulated macrophages up-regulated the mRNA expression of cytokines and N-cadherin, and down-regulated the mRNA expression of E-cadherin in the HepG2 cells. CONCLUSION: Palmitate-stimulated macrophages promote the invasion and migration of HepG2 cells through paracrine/endcrine loop.

Palmitate; HepG2 cells; Macrophages; Inflammatory cytokines; Cell invasion; Cell migration

1000- 4718(2017)03- 0495- 05

2016- 10- 26

2016- 12- 12

国家自然科学基金资助项目(No. 31540029); 重庆市科委科技计划(No. cstc2016jcyjA0545)

△通讯作者 Tel: 023-68486780; E-mail: laleinlz@hotmail.com

R363.2; R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.03.018