一种改良方法制备大鼠痛风模型及其炎症和疼痛效应评价*

柴文新 施合欢 金雯丽 台 燕 刘伯一△ 方剑乔△

（

1 浙江中医药大学第三临床医学院针灸神经生物学实验室，杭州310053；2 浙江中医药大学实验室设备管理处，杭州310053）

·论 著·

一种改良方法制备大鼠痛风模型及其炎症和疼痛效应评价*

柴文新1施合欢1金雯丽1台 燕2刘伯一1△方剑乔1△

（

1浙江中医药大学第三临床医学院针灸神经生物学实验室，杭州310053；2浙江中医药大学实验室设备管理处，杭州310053）

目的：采用一种改良方法制备急性痛风性关节炎大鼠模型，并对造模后大鼠出现的急性痛风性关节炎的主要症状，即关节局部炎症和疼痛进行分析和评价。最后验证吲哚美辛是否能够对该模型大鼠发挥有效镇痛作用。方法实验一：把24只雄性SD大鼠采用随机数字表法分为模型组和对照组（n = 6）。模型组大鼠左踝后侧沿跟腱内侧以30～40°方向穿刺关节腔，注射1.25 mg/50 µl尿酸钠，制备大鼠急性痛风性关节炎模型。对照组则以同样方式注射等量磷酸盐缓冲液。对两组大鼠造模前及造模后的2 h，4 h，8 h，24 h和48 h踝关节肿胀程度测量，进一步利用动物行为学方法对大鼠疼痛行为学指标进行检测，包括自发性疼痛行为评分、机械缩爪阈值和热痛敏潜伏期。实验二：将12只雄性SD 大鼠随机分为模型组和对照组 (n = 6)，造模后24 h对其踝关节滑膜组织进行病理学分析。实验三：把18只雄性SD 大鼠随机分为模型组、对照组和治疗组 (n = 6)。模型成功建立后，进一步利用行为学方法观察腹腔注射吲哚美辛后对模型大鼠4 h，8 h，24 h机械缩爪阈值的影响。结果：实验一：利用改良法造模2 h后，与对照组相比，模型组大鼠踝关节开始出现明显肿胀，模型组踝关节肿胀情况可持续48 h以上。造模2 h后，模型组大鼠开始出现自发性疼痛行为，并且机械缩爪阈值开始出现显著降低 (P ＜ 0.05)。造模4 h后，热痛敏潜伏期也开始出现显著下降 (P ＜ 0.05)。模型组大鼠上述各项疼痛指标一直持续到模型建立后的第24 h (P ＜ 0.01)。实验二：模型组大鼠踝关节滑膜组织相比对照组出现广泛炎性细胞浸润。实验三：吲哚美辛可以有效缓解该模型大鼠机械痛过敏情况 (P ＜ 0.05)。结论：采用该改良方法制备急性痛风性关节炎大鼠模型方法简单，重现性好，可引发大鼠出现明显关节炎症及疼痛等急性痛风性关节炎表现的主要临床症状。并且非甾体抗炎药对该模型可发挥显著镇痛作用。因此提示这一方法可用于急性痛风性关节炎动物模型制备，并用于镇痛药物的筛选，值得进一步推广。

急性痛风性关节炎；机械缩爪阈值；热痛敏潜伏期；炎症；疼痛；吲哚美辛

急性痛风性关节炎是由于单尿酸钠盐(monosodium urate, MSU) 结晶沉积在关节周围组织引起的急性炎症反应[1,2]。关节肿胀与关节部位剧痛是该病病人最明显的临床症状，严重时还会造成关节畸形。急性痛风性关节炎会给病人身体带来难以忍受的痛苦和心理上的巨大负担。近年来，随着我国经济的高速发展、人口老龄化趋势日渐明显以及饮食结构的改变，痛风发病人数正在逐年上升，已经成为人民健康的重大威胁。目前国内外尚无任何根治痛风的办法。西医治疗药物分为治疗痛风性关节炎和纠正高尿酸血症。前者有非甾体抗炎药、秋水仙碱和糖皮质激素等，它们能快速有效缓解疼痛，减轻炎症；后者包括别嘌呤醇等抑制尿酸生成的黄嘌呤氧化酶抑制剂和丙磺舒、苯溴马隆等促进尿酸排泄的药物。上述药物虽然可暂时缓解痛风症状，然而伴随的不良反应较多。

稳定的痛风性关节炎动物模型的建立能够为痛风发病机制的阐明以及相关治疗药物的筛选提供巨大帮助。国内外有几种急性痛风性关节炎大鼠模型的制备方法[3～7]，但是目前普遍采用的仍然是Coderre提出的方法，即从踝关节背侧以45°方向沿胫骨内侧穿刺踝关节腔，注射200 µl MSU，从而诱导急性痛风性关节炎[8,9]。然而近期有研究发现这种穿刺方法会破坏大鼠踝关节部位软骨组织，导致滑膜组织充血水肿，诱发创伤性关节炎产生，并且容易导致MSU向其他部位弥散，从而严重干扰实验结果[10]。该研究又进一步提出了一种改良后的踝关节穿刺方法，即将注射器在大鼠踝关节后侧沿跟腱内侧30°刺入关节腔，注射50 µl MSU。这种改良方法相比传统方法操作更加简单，并且对大鼠踝关节创伤小，能够显著提高模型制备的准确性和重现性[10]。然而这项研究仅利用该方法对大鼠踝关节注射了一定体积生理盐水，并未进行模型制备。因此尚不能肯定利用该改良方法是否可以成功建立稳定的大鼠急性痛风性关节炎模型。

本研究准备进一步利用该改良方法向大鼠踝关节腔注射一定剂量MSU（50 µl），并通过对大鼠踝关节炎症以及若干疼痛行为学指标进行观察，从而确立该方法是否可以用于急性痛风性关节炎模型的建立。我们发现采用该改良方法制备急性痛风性关节炎大鼠模型方法简单，重现性好，可引发大鼠出现明显关节炎症及疼痛等急性痛风性关节炎表现的主要临床症状，并且非甾体抗炎药对该模型可发挥显著镇痛作用。因此提示这一方法可用于急性痛风性关节炎动物模型制备，并用于镇痛药物的筛选，值得进一步推广。

方 法

1.实验动物

清洁级雄性SD大鼠，体重(220±20) g，均购于中国科学院上海实验动物中心，合格证号（2013-0016）。

2.主要仪器与试剂

磷酸盐缓冲液（批号：20161110，凯基生物公司生产）、尿酸钠（批号：BCBR7559V，Sigma公司生产）、吲哚美辛（批号：17378，Sigma公司生产）、足底热辐射测痛仪（37370，意大利UGO BASILE ）、纤毛机械刺激针（Von Frey Hairs test触觉纤维丝，美国Stoelting）、美奈特数码游标卡尺（上海美奈特实业有限公司）。

3. 分组与造模

大鼠适应性喂养6天，采用随机数字表法对大鼠进行分组。实验一：24只雄性SD 大鼠分为对照组（Veh组）、模型组（MSU组），每组12只。实验二：雄性12只SD 大鼠分为对照组（Veh组）、模型组（MSU组），每组6只。实验三：雄性18只SD 大鼠分为模型组（MSU + Veh组）、对照组（Veh组）和治疗组（MSU + Indo组），每组6只。MSU组、MSU + Veh组和MSU + Indo组参照吕军等人报道的改良方法于大鼠左踝后侧沿跟腱内侧以30～40°方向穿刺关节腔，注射1.25 mg/50 µl尿酸钠，Vehicle组则以同样方式注射等量磷酸盐缓冲液[10]。MSU + Indo组腹腔注射100 µl吲哚美辛(10 mg/kg)，MSU + Veh组腹腔注射100 µl相应溶剂。

4.踝关节肿胀程度

采用数码游标卡尺测量造模前以及模后不同时间点大鼠内外踝之间的直径，连续测量三次并取其均值作为检测结果。踝关节肿胀程度 = 测定时间点关节直径 - 初始直径。

5.踝关节滑膜组织病理学观察

实验二在造模后24 h，处死Vehicle组和MSU组大鼠并取大鼠患侧的踝关节滑膜组织于 4%多聚甲醛固定， 经脱水，包埋，切片后进行苏木素一伊红染色。光镜下观察组织病理学改变。

6.自发性疼痛行为学评分

造模后第2 h、4 h、8 h和24 h将大鼠置于透明观察箱中，预适应20分钟。待大鼠安静后，根据大鼠足爪表现的形态进行等级评分[9]。0分：正常情况，右爪完全着地；1分：右爪未完全展开，出现缩爪现象；2分：右爪轻微抬起；3分：右爪完全抬起。

7.50% 机械缩爪阈值（paw withdrawal threshold, PWT）检测

分别于造模前和造模后的第2 h、4 h、8 h和24 h，采用Chaplan等创建的经典的von-Frey刺激丝（力量分别是 0.4、0.6、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、15.0 g和26.0 g）Up-Down方法对两组大鼠进行机械痛阈的检测[11,12]。测量前，先把大鼠放在特定的铁丝网上，并盖上透明的有机玻璃罩（20 cm×20 cm×15 cm）。待大鼠逐渐适应环境，从而安静下来（停止探索和梳理毛发）。大鼠安静后，首先从4.0 g开始，我们把von-Frey丝垂直刺向大鼠足底中央（避开足垫），垂直用力使其轻微弯曲，每次的刺激时间≤ 5 s，间隔时间＞ 2 min。当大鼠出现缩足或者舔足即为阳性反应，那么我们就记录下“X”，下一次就换大一级的6.0 g来刺激；反之，若出现阴性反应（大鼠一动不动），那么记录下“O”， 接下来换小一级的2 g继续刺激。由此可得到一串以“O”或“X”组合的序列。我们以第一次出现“X”的前一次“O”作为起点，选择包括该起点的连续6次的检测结果作为推算50% PWT的关键序列。计算公式为50%PWT(g) = 10^ (xf+k*δ-4)。xf为序列中最后一根von Frey丝的对数值，k为根据检测所得“X”“O”序列查表所得，δ在此约为0.231。

8.足爪热痛敏潜伏期 (Paw withdrawal latency,PWL) 检测

分别于造模后的2 h，4 h，8 h，24 h和48 h时间点，采用足底热痛敏测试仪(Ugobasile, Italy)检测两组大鼠患侧足趾PWL。测量时，将大鼠置于透明有机玻璃箱内，室温保持在25±2℃。大鼠安静后（停止梳理毛发和探索性活动），将测试仪上的“十”字形标记置于大鼠左后跖足底中央并避开足垫。接下来开启仪器，从开始至大鼠出现抬腿回避的时间作为大鼠的热痛阈值。每只脚照射 3 次，每次间隔 5～6 min。我们把3次结果的平均值作为大鼠的PWL。为防止大鼠被热辐射烫伤，我们将PWL测定的时间上限值设定为 20 s[13]。

9. 吲哚美辛对痛风大鼠镇痛疗效观察

实验三于造模后的6 h和22 h，MSU + Veh组大鼠腹腔注射100 µl溶剂，MSU + Indo组大鼠腹腔注射100 µl吲哚美辛(10 mg/kg)。Vehicle组不造模，只在踝关节注射生理盐水。分别于造模后的0 h，4 h，8 h，24 h时间点，对MSU + Veh、MSU + Indo和Vehicle组三组大鼠进行PWT的检测。

10.统计学分析

结 果

1.在实验一造模后对照组和模型组大鼠踝关节形态学及肿胀程度进行观察

造模24 h后，与对照组大鼠相比，模型组大鼠左足踝关节部位出现明显肿胀（见图1）。

图1 造模后对照组和模型组大鼠患侧足爪对比A ：对照组（Vehicle组）；B：模型组（MSU组）Fig.1 The comparison of the paw of rats between Vehicle and MSU-treated group A: Vehicle group; B: MSU group.

接下来对大鼠踝关节肿胀程度随时间的变化进行观察。造模前，两组大鼠左足踝关节直径相比并无显著统计学差异。在造模后的第2 h、4 h、8 h、24 h和48 h，模型组大鼠踝关节肿胀程度相比对照组出现显著上升（P ＜ 0.01）。踝关节肿胀程度在MSU注射后第2 h迅速达到高峰，且一直持续24 h（P ＜ 0.01）。在24 h后踝关节肿胀程度逐渐出现下降，但在第48 h，与对照组相比，模型组仍表现出明显肿胀现象（P ＜ 0.01，见图2）。

图2 造模后不同时间点两组大鼠踝关节肿胀程度比较(n=12,±SEM)**P ＜ 0.01，与 Vehicle 组相比Fig.2 The comparison of paw swelling of Vehicle and MSU-treated group in different time points (n=12,±SEM)**P ＜ 0.01, compared with Vehicle group.

2.实验二对造模后24 h大鼠踝关节滑膜组织病理学进行观察

由图3A和B可知，H&E染色结果提示，造模后24 h，与对照组相比，模型组大鼠左踝关节滑膜组织出现了广泛炎性细胞浸润现象（见图3）。

图3 滑膜组织H&E染色 (×40, Bar scale = 50 µm)造模后24 h大鼠踝关节滑膜组织病理学观察 A ：Vehicle组；B：MSU组Fig.3 Ankle synovial tissue pathology analysis of Vehicle and MSU-treated group 24 h after model establishment (×40, Bar scale = 50 µm)A: Vehicle group; B: MSU group.

3.实验一造模后不同时间点大鼠表现的自发性疼痛行为学评分

由图4可知，在造模前，两组大鼠自发性疼痛行为学评分无显著统计学差异。在造模后的第2 h、4 h、8 h和24 h，模型组大鼠左侧后肢表现出明显的缩爪、抬爪等与自发性疼痛相关的行为学变化。模型组自发性疼痛行为学评分相比对照组显著上升（P ＜ 0.01或P ＜ 0.05），且在第8 h表现最为明显（P ＜ 0.01）。造模后第48 h，模型组大鼠自发性疼痛行为恢复正常水平，与对照组评分相比无显著统计学差异（见图4）。

图4 造模后不同时间点两组大鼠的自发性疼痛行为学评分(n=12,±SEM)* P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，与 Vehicle组相比Fig.4 The ongoing pain score of Vehicle and MSU groups at each time point after model establishment (n=12,±SEM)* P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01, compared with Vehicle group.

4.造模后不同时间点大鼠机械痛过敏行为的观察

由图5可知,造模前两组大鼠50% PWT无显著统计学差异。在造模后的第2 h，模型组大鼠50% PWT开始出现显著下降，提示机械痛过敏现象的发生（P ＜ 0.05）。这种机械痛过敏可一直持续到模型建立后的第24 h。在第48 h，模型组大鼠的机械痛过敏现象逐渐得到恢复（见图5）。

5.实验一造模后不同时间点大鼠热痛觉过敏现象的观察

由图6可知，造模前，模型组和对照组大鼠PWL无显著统计学差异。从造模后第4 h开始，模型组大鼠的PWL出现显著下降， 提示热痛觉过敏现象的发生（P ＜ 0.05或P ＜ 0.01）。这种热痛觉过敏现象可一直持续到模型建立后的第24 h。在第48 h，模型组大鼠热痛觉痛过敏现象逐渐得到恢复（见图6）。

图5 造模后不同时间点两组大鼠50% PWT的比较(n=12,±SEM)* P ＜ 0.05,**P ＜ 0.01，与 Vehicle 组相比Fig.5 The PWT of rats in two groups at each time point after model establishment (n=12,±SEM)* P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01, compared with Vehicle group.

图6 造模后不同时间点两组大鼠PWL相比较(n=12,±SEM)* P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，与 Vehicle组相比Fig.6 The PWL of rats in two groups at each point after modelestablishment(n=12,±SEM)* P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01, compared with Vehicle group.

6.实验三中吲哚美辛对痛风大鼠镇痛疗效观察

由图7可知，造模前三组大鼠50% PWT无显著统计学差异。在造模后第4 h，MSU + Veh组和MSU + Indo组大鼠50% PWT出现明显下降，提示造模成功(P ＜ 0.01)。分别于模后6 h和22 h腹腔给予吲哚美辛治疗后， MSU + Indo组大鼠50% PWT在模后8 h和24 h相比于MSU + Veh组出现显著上升(P ＜ 0.05或P ＜ 0.01)。这一结果提示吲哚美辛对急性痛风性关节炎大鼠具有良好镇痛作用。

图7 吲哚美辛对痛风模型大鼠镇痛作用研究(n=6,±SEM)A：模型制备，吲哚美辛给药和PWT测定时间点示意图；B：吲哚美辛对模型大鼠PWT的影响**P ＜ 0.01，与 Control组相比；#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01，与MSU + Veh组相比Fig.7 The analgesic effect of indomethacin on the rat gout model(n=6,±SEM)**P ＜ 0.01, compared with Control group; # P ＜ 0.05,# # P ＜ 0.01, compared with MSU + Veh group.

讨 论

随着急性痛风性关节炎的发病率逐渐升高[14]，因此急性痛风性关节炎的发病机制和治疗方法逐渐成为人们所关注的问题。制备合适的动物模型对于探索急性痛风关节炎的产生机制具有重要意义。长期以来，Coderre和Wall提出的大鼠踝关节背侧穿刺法一直是经典的痛风关节炎造模方法[8,9]。然而近期吕军等人的研究指出，按照Coderre和Wall方法进行踝关节穿刺会导致大鼠关节软骨面的损伤，部分脱落的关节软骨会残留在踝关节腔内，导致周围滑膜组织充血水肿，形成创伤性关节炎，从而对实验结果产生干扰[10]。此外，Coderre方法中使用200 µl MSU注射踝关节腔，这一剂量也远超大鼠踝关节实际容积，从而容易使MSU弥散到足部其他部位。吕军等人在研究中进一步提出了一种改良的踝关节穿刺方法，即将注射器在大鼠踝关节后侧沿跟腱内侧30°刺入关节腔，注射50 µl试剂[10]。这种改良方法相比传统方法操作更加简单，并且对大鼠踝关节创伤小，试剂分布更集中于踝关节腔，从而能够显著提高模型制备的准确性和重现性。然而在这项研究中，作者只是利用该改良方法对大鼠踝关节腔注射了一定剂量的生理盐水，而并未对注射MSU后是否可以成功建立大鼠急性痛风关节炎模型以及模型大鼠表现的炎症、疼痛指标进行研究和评价。

在本项研究中，我们采用了吕军等人提出的这种改良方法，并进一步向大鼠踝关节腔注射50µl MSU，尝试建立大鼠急性痛风关节炎模型。我们的研究发现，利用该方法建立MSU模型，方法操作简单，重现性好。所有MSU注射大鼠均表现出明显的踝关节肿胀。此外，急性痛风关节炎发作期的主要病理学变化之一是关节滑膜出现炎性细胞浸润。而我们的研究发现，利用该方法制备大鼠急性痛风关节炎模型，模型大鼠的踝关节滑膜组织可出现明显炎性细胞浸润现象，因此这一病理变化与急性痛风关节炎的主要病理变化相符。

此外，我们又对利用该方法所建立的大鼠急性痛风性关节炎模型表现出的疼痛行为进行了详细研究。我们发现在大鼠踝关节注射MSU 2小时后，大鼠开始出现明显的缩爪、抬爪和舔爪等自发性疼痛行为，并且这种自发性疼痛行为可一直持续到MSU注射后的第24小时。除了自发性疼痛行为之外，我们还对MSU组大鼠表现的机械痛觉过敏和热痛觉过敏现象进行了观察。我们发现在踝关节注射MSU 2小时后，MSU组大鼠开始出现机械缩爪阈值的显著降低。而在MSU注射4小时后，MSU组大鼠的热痛敏潜伏期亦开始出现显著下降。这种机械痛觉和热痛觉过敏现象可以一直持续到MSU注射后的第24小时。

此外，我们还检测了吲哚美辛对该模型大鼠的镇痛效应。众所周知，吲哚美辛是一种非甾体抗炎药，具有良好抗炎和镇痛作用，临床上常用于急性痛风性关节炎治疗。在实验中我们采用吲哚美辛对该痛风模型大鼠进行治疗后，发现吲哚美辛能够有效缓解大鼠疼痛症状。我们推测吲哚美辛的这一镇痛作用与其有效抑制炎症部位环氧合酶活性从而减少了前列腺素的合成密切相关。这一结果证明抗炎镇痛药物可以对该方法制备的大鼠急性痛风关节炎模型发挥有效镇痛作用。而这与临床上吲哚美辛对痛风病人的治疗效果一致。

综上所述，本研究采用的改良方法制备的急性痛风性关节炎大鼠模型稳定，重现性好，能够有效引发大鼠出现明显关节部位炎症和疼痛症状，并且经典的抗炎镇痛药物可对该模型发挥有效镇痛疗效。因此这一改良方法适用于急性痛风性关节炎大鼠模型的制备，并可用于筛选和研发有效治疗痛风性关节炎的药物，值得进一步推广。

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STUDY OF A MODIFIED ACUTE GOUTY ARTHRITIS RAT MODEL AND THE EVALUATION OF INFLAMMATION AND PAIN*

CHAI Wen-Xin1, SHI He-Huan1, JIN Wen-Li1, TAI Yan2, LIU Bo-Yi1△, FANG Jian-Qiao1△
(1Department of Neurobiology and Acupuncture Research, The Third Clinical Medical College, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China;2Laboratory and Equipment Administration, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China)

Objective:A modified method was used to establish acute gouty arthritis (AGA) rat model. The major symptoms, including ankle joint in fl ammation and pain of AGA rats as well as the analgesic effect of indomethacin were evaluated.Methods:Twenty-four male SD rats were randomly divided into Vehicle group and MSU group (n = 12) in Experiment #1. Rats of MSU group were injected with 1.25 mg/50 µl monosodiumurate in the rear side of left ankle in 30-40°angle, following the interior side of Achilles tendon. Rats of Vehicle group were injected with the same volume of phosphate buffered saline. The ankle swelling of these two groups was measured before model establishment and 2, 4, 8, 24 and 48 h thereafter. Animal behavioral assay was further used to evaluate the nocifensive behavior, which included ongoing pain score, mechanical paw withdrawal threshold (PWT) and thermal paw withdrawal latency (PWL).Twelve male SD rats were randomly divided into MSU group and Vehicle group in Experiment #2 .The pathological changes of ankle synovial tissue were evaluated at 24 h after model establishment. Eighteen male SD rats were randomly divided into MSU group, Vehicle group and Treatment group (n = 6) in Experiment #3. After the successful establishment of the model, the therapeutic effect of indomethacin on PWT was further evaluated 4, 8, 24 h thereafter.Results:2 h after the model establishment, the MSU group showed obvious ankle joint swelling compared with Vehicle group in Experiment #1. The swelling lasted up to 48 h. The MSU group showed obvious ongoing pain behavior and the PWT began to decline significantly 2 h after model establishment(P ＜ 0.05). PWL also exhibited signi fi cant decline (P ＜ 0.05), 4 h after the model establishment. These pain-related behaviors remained until 24 h after the model establishment (P ＜ 0.01). MSU group showed extensive in fl ammatory cell in fi ltration in Experiment #2. Furthermore, indomethacin signi fi cantly alleviated the mechanical hyperalgesia of the MSU rats (P ＜ 0.05) in Experiment #3.Conclusions:The modi fi ed model of AGA is simple and shows good reproducibility. It induces obvious ankle swelling and pain-related behavior in tested rats, which are the major clinical manifestations of AGA. Therefore, our results suggest that this modi fi ed method can be used to establish animal models of AGA and can be further used for screening of potential analgesic drugs.

Acute Gout Arthritis; Paw Withdrawal Threshold；Paw Withdrawal Latency；In fl ammation；Pain；Indomethacin

10.3969/j.issn.1006-9852.2017.10.003

国家自然科学基金（81603676）；浙江省自然科学基金“杰出青年基金”（LR17H270001）；浙江省中山医院“新星人才”（2016XXRC02）；浙江省“钱江人才计划”资助项目；浙江省一流学科中医学研究生创新计划（2017202）；浙江省新苗人才计划（2017R410011）

△ 通讯作者 刘伯一boyi.liu@foxmail.com；方剑乔fangjianqiao7532@163.com