槲皮素调控Nrf2/HO-1 信号通路抗氧化应激的机制研究

★ 余良昆 李勇 钟发明 龙世杰 熊朋朋 刘欣 徐王兵（.江西中医药大学研究生院 南昌 330004；.江西中医药大学附属医院脊柱一科 南昌 330006）

骨质疏松症（osteoporosis，OP）是由多种因素引起的慢性疾病，其特征是骨量下降和骨微结构破坏，导致骨折风险增加［1-2］。随着人口老龄化的加剧，骨质疏松症的发病率也在逐年上升［3］。在世界范围内，每3 s 就会发生一起骨质疏松性骨折，这不仅给病人带来痛苦，也给社会带来了沉重的经济负担［4］。

研究发现，氧化应激是骨质疏松症发生和发展的关键因素［5-6］。雌激素缺乏和衰老都可以诱导氧化应激，从而增加活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生，过量的ROS 会导致细胞内脂质、蛋白质和DNA 损害，最终诱导细胞凋亡［7-8］。此外，ROS 会减少成骨细胞形成，提高破骨细胞骨吸收水平［9］。临床上，一些抗氧化剂如维生素E、维生素C 和乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）已被用作骨质疏松症的替代治疗剂，并取得了可观的治疗效果［10-11］。

槲皮素在植物界分布广泛，是具有多种生物活性的黄酮醇类化合物，具有抗氧化、抗凋亡和抗骨质疏松的作用［12-13］。槲皮素能够直接清除自由基、抑制脂质过氧化。有研究表明，槲皮素能促进成骨细胞的分化，抑制破骨细胞的形成［14］。这些证据表明，槲皮素对维持骨稳态具有积极作用，然而槲皮素对氧化应激状态下的MC3T3-E1 细胞的保护作用及分子机制尚未明确。因此，本研究通过构建氧化应激损伤细胞模型，探讨槲皮素对MC3T3-E1细胞的保护作用及潜在分子机制。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

槲皮素（纯度＞98%，CAS：117-39-5），购自成都瑞芬思生物科技有限公司；3%过氧化氢溶液（hydrogen peroxide，H2O2）、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠、地塞米松购自德国默克公司；胎牛血清、MEMα培养基购自赛默飞生物公司；青霉素、链霉素购自海克隆生物公司；CCK-8 试剂盒、总SOD 活性检测试剂盒、MDA 检测试剂盒、碱性磷酸酶染色试剂盒、碱性磷酸酶活性检测试剂盒购自上海碧云天生物公司；茜素红S 染色溶液购自赛业生物公司；引物合成由北京擎科生物公司完成；一抗Runx2、Osterix、Nrf2、HO-1、β-actin 购自Cell Signaling Technology公司；Bax、Bcl-2、Caspase3 购自Affintiy 公司；二抗购自Affintiy 公司。

1.2 细胞培养

小鼠胚胎成骨细胞（MC3T3-E1）购自武汉大学中国典型培养物保藏中心。将细胞培养在含有10%胎牛血清和1%抗生素的MEMα 培养基中，细胞每2 d 更换一次培养基，当细胞融合至80%～90%时进行传代。P3-P6 代细胞用于后续实验。

1.3 MC3T3-E1 细胞氧化应激模型的构建及药物干预

本研究使用200 μmol/L H2O2干预细胞构建氧化应激损伤模型［15］，细胞分为对照组、模型组（200 μmol/L H2O2）、低浓度组（200 μmol/L H2O2+2.5 μmol/L 槲皮素）、高浓度组（200 μmol/L H2O2+5 μmol/L 槲皮素）。

1.4 MC3T3-E1 细胞增殖检测

将细胞接种到96 孔板（每孔3×103个细胞）中，细胞贴壁后，在含或不含H2O2的培养基中加入不同浓度的槲皮素（0，1，2.5，5，10，20，40 μmol/L）干预24 h，干预结束后，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，37 ℃孵育2 h，使用酶标仪检测450 nm 处的吸光值。

1.5 MC3T3-E1 细胞成骨诱导及ALP、ARS 染色

将细胞接种到12 孔板（每孔1×105个细胞）中，细胞贴壁后分组干预并使用成骨诱导培养基（地塞米松：10 nmol/L，维生素C：50 μg /mL，β-甘油磷酸钠：10 mmol/L）进行成骨诱导。细胞分为单纯成骨诱导组（对照组）、成骨诱导+200 μmol/L H2O2组（模型组）、低浓度组（成骨诱导+200 μmol/L H2O2+2.5 μmol/L 槲皮素）、高浓度组（成骨诱导+200 μmol/L H2O2+5 μmol/L 槲皮素），细胞每3 d更换一次培养基。成骨诱导7 d 后进行ALP 染色，使用PBS 清洗细胞3 遍，4%多聚甲醛固定30 min，PBS 清洗3 遍后进行ALP 染色。成骨诱导14 d 后进行ARS 染色，使用PBS 清洗细胞3 遍，4%多聚甲醛固定30 min，PBS 清洗3 遍后进行ARS 染色。

1.6 细胞内总SOD 含量检测

将细胞接种到 6 孔板（每孔3×105个细胞）中，细胞贴壁后按上述分组干预细胞24 h。干预结束后收集各组细胞样品，按照SOD 活性检测试剂盒说明书配置工作液，37 ℃孵育30 min 后使用酶标仪检测450 nm 处的吸光值。根据标准曲线计算各组细胞样品的SOD 活性。

1.7 细胞内总MDA 含量检测

细胞干预如前所述，干预结束后收集各组细胞样品，按照MDA 检测试剂盒说明书配置工作液，与样品混匀后100 ℃加热15 min，水浴冷却至室温，1 000 g 室温离心10 min。取200 μL 上清液加入到96 孔板中，随后用酶标仪在532 nm 处测定吸光度。根基标准曲线计算各组细胞样品中的MDA含量。

1.8 qRT-PCR

将细胞以每孔3×105个细胞的密度接种于6 孔板，干预方式如前所述，干预结束后收集各组细胞，使用RNA 提取试剂盒提取总RNA，测量浓度后使用PrimeScript RT reagent 试剂盒将RNA 逆转录成cDNA。采用SYBR Green 染色法，以各组cDNA 为模板，加入缓冲液、引物后参考说明书采用以下参数进行PCR 扩增：95 ℃ 30 s，95 ℃5 s，60 ℃ 40 s，共40 个循环。以18 s 为内参，采用2-ΔΔCt法计算相对mRNA 表达量。所有引物序列见表1。

表1 引物序列

1.9 Western blot

细胞干预结束后使用Ripa 裂解液提取总蛋白。使用SDS-PAGE 胶电泳分离蛋白，随后转移到 PVDF 膜，用5%脱脂牛奶于室温下封闭 2 h，加入一抗Runx2、Osterix、Nrf2、HO-1、β-actin、Bax、Bcl-2、Caspase3 在4 ℃孵育12 h，孵育结束后使用 TBST 清洗3 遍，二抗孵育1.5 h，TBST 清洗3 次后使用凝胶成像仪进行显影。

1.10 统计学方法

2 结果

2.1 槲皮素对MC3T3-E1 细胞活力和增殖的影响

CCK-8 结果显示10 μmol/L 以下浓度的槲皮素对MC3T3-E1 细胞无明显毒性作用，当槲皮素浓度大于20 μmol/L 时会对细胞的增殖产生明显的抑制作用（P＜0.05），见表2。此外，200 μmol/L H2O2明显抑制MC3T3-E1 细胞增殖（P＜0.05），槲皮素（1，2.5，5，10，20 μmol/L）能够减轻H2O2对MC3T3-E1 细胞增殖抑制（P＜0.05），见表3。这说明槲皮素对氧化应激状态下的MC3T3-E1 细胞具有保护作用。结果可知2.5，5 μmol/L 浓度的槲皮素对细胞没有毒性作用，因此选择2.5，5 μmol/L 浓度的槲皮素进行后续实验。

表2 槲皮素对MC3T3-E1细胞活性的影响

表3 槲皮素对H2O2诱导的MC3T3-E1细胞活性的影响

2.2 槲皮素对MC3T3-E1 细胞成骨分化功能的影响

通过比较各组ALP、ARS 染色结果，发现200 μmol/L H2O2明显降低了MC3T3-E1 细胞的成骨分化能力。见图1。相比于对照组，模型组细胞的ALP 染色颜色更浅；此外，ARS 染色颜色较浅，观察到的矿化结节数量也较少。然而，槲皮素组的ALP、ARS 染色颜色较模型组深，ARS 染色观察到更多的矿化结节，表明槲皮素能够减轻H2O2诱导的MC3T3-E1 细胞成骨分化功能障碍。

图1 ALP、ARS染色评估槲皮素对H2O2诱导的MC3T3-E1细胞成骨分化功能的影响

2.3 槲皮素对氧化应激的影响

丙二醛（malondialdehyde，MDA）是一种重要的氧化应激物质，能够诱导活性氧（reactive oxygen species，ROS）的形成。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是生物体内存在的一种抗氧化金属酶，它能够催化超氧阴离子自由基歧化生成氧和H2O2，在机体氧化与抗氧化平衡中起到至关重要的作用。通过检测细胞内MDA 含量，发现H2O2干预后明显增加了细胞内MDA 含量（P＜0.05），而槲皮素以浓度依赖的方式降低了细胞内MDA 含量。此外，发现H2O2明显降低了细胞内SOD 活性，槲皮素干预后增加了细胞内SOD 活性（P＜0.05），表明槲皮素具有很好的抗氧化作用。见表4。

表4 槲皮素对H2O2诱导的MC3T3-E1细胞中MDA、SOD水平的影响

2.4 槲皮素对成骨分化和凋亡的影响

qRT-PCR 检测结果表明，H2O2干预明显降低了细胞中Runx2 和Osterix 的表达，槲皮素干预后以剂量依赖方式增加了它们的表达。此外，H2O2干预明显增加了细胞中凋亡相关基因Bax、Caspase3 的表达，降低了Bcl-2 的表达。然而，槲皮素干预后降低了Bax、Caspase3 的表达，增加了Bcl-2 的表达（P＜0.05），见表5。Western blot 得到了类似的结果，相较于模型组，槲皮素干预后增加了Runx2、Osterix 和Bcl-2 的蛋白表达，降低了Bax、Caspase3 的蛋白表达（P＜0.05），见表6、图2。这些结果表明，槲皮素能够减轻H2O2诱导的MC3T3-E1 细胞凋亡，增强MC3T3-E1 细胞氧化应激状态下的成骨分化功能。

图2 Western blot检测Runx2、Osterix、Bax、Bcl-2和Caspase3的代表性条带

表5 槲皮素对H2O2诱导的MC3T3-E1细胞中Runx2、Osterix、Bax、Bcl-2和Caspase3基因表达的影响

表6 槲皮素对H2O2诱导的MC3T3-E1细胞中Runx2、Osterix、Bax、Bcl-2和Caspase3蛋白表达的影响

2.5 槲皮素对Nrf2/HO-1 信号通路的影响

为进一步研究槲皮素在MC3T3-E1 细胞中的抗氧化机制，Western blot 实验发现H2O2干预后部分增加了Nrf2、HO-1 的蛋白表达，相较于对照组和模型组，槲皮素干预后明显增加了Nrf2、HO-1 的蛋白表达（P＜0.05），见图3、表7。这些结果表明，槲皮素可能是通过激活Nrf2/HO-1 信号通路减轻MC3T3-E1 细胞中H2O2诱导氧化应激损伤。

图3 Western blot检测Nrf2和HO-1的代表性条带

表7 槲皮素对H2O2诱导的MC3T3-E1细胞中Nrf2和HO-1的蛋白表达水平的影响

3 讨论

研究表明过量的ROS 会抑制成骨细胞骨形成，增加破骨细胞骨吸收，导致骨丢失和骨质疏松［16］。有研究发现，绝经后骨质疏松症妇女的BMD 下降与血浆脂质的高氧化性和SOD、H2O2酶和谷胱甘肽过氧化物酶的功效降低有关［17-19］。因此，寻找新的抗氧化剂来抑制氧化损伤已经成为预防和治疗骨质疏松症的策略。H2O2是一种活性氧，它可以穿过生物膜并产生广泛损伤，据报道，H2O2能够诱导各种类型细胞的凋亡或坏死［20-21］。Sun等［22］研究表明，200 μmol/L H2O2处理24 h 显著减低MC3T3-E1 细胞的生存率，200 μmol/L H2O2适合于诱导体外氧化应激模型。因此，在本研究中使用200 μmol/L H2O2构建氧化损伤模型。数据显示，H2O2处理后明显增加了细胞内MDA 含量，而槲皮素以浓度依赖的方式降低了细胞内MDA含量。此外，我们发现槲皮素干预后增加了细胞内SOD活性，这表明槲皮素处理后在一定程度上减轻了H2O2的毒性。

据报道，H2O2诱导的氧化损伤会降低成骨分化标志物的表达，抑制成骨细胞分化［23-24］。我们的研究表明，H2O2干预与细胞碱性磷酸酶活性降低、钙矿化减少、成骨基因Runx2 和Osterix 表达降低有关。此外，数据显示，槲皮素可以逆转H2O2诱导的成骨分化抑制。因此，我们推测槲皮素的抗氧化特性提高了MC3T3-E1 细胞的存活率，降低了氧化应激损伤和成骨分化抑制。

细胞凋亡是一种程序性的细胞死亡，受到多种因素的严格调控［25］。有研究表明，H2O2可诱发成骨细胞的凋亡，导致骨微结构的改变，从而导致骨质疏松症［26］。细胞凋亡受到多个基因的严格控制，包括Bcl-2 家族和Caspase 家族。Bcl-2 通过调节促凋亡和抗凋亡之间的平衡来维持线粒体的完整性，而Bax 通过增强线粒体膜通透性和改变跨膜电位来促进细胞色素C 从线粒体释放到细胞质中，引起半胱氨酸天冬氨酸裂解酶的级联反应，最终导致Caspase3 的激活并引发细胞凋亡［27-28］。在本研究中，Western blot 结果显示，H2O2处理明显增加了MC3T3-E1 细胞中Bax 和Caspase3 的蛋白表达，并下调了Bcl-2 的表达。然而，槲皮素干预后降低了Bax 和Caspase3 的表达，增加了Bcl-2的表达。这些结果表明，槲皮素可以减轻氧化应激引起的细胞凋亡。

Nrf2 是一个众所周知的转录因子，在抗氧化中起着关键作用。最近，Nrf2/HO-1 信号通路被证明可作为一种内源性抗氧化剂，拮抗多个器官中的氧化应激损伤［29］。实验证实，激活Nrf2/HO-1 信号通路能够增强多种抗氧化剂的表达，保护心肌细胞免受氧化应激损伤［30］。

此外，多项研究表明，Nrf2/HO-1 信号通路在骨质疏松症起重要作用［31］。在本研究中，我们发现槲皮素明显增加了Nrf2、HO-1 的蛋白表达，这说明槲皮素能够激活Nrf2/HO-1 信号通路，减轻MC3T3-E1 细胞的氧化应激损伤、凋亡和成骨分化功能障碍。

综上所述，本研究通过构建体外氧化应激模型研究槲皮素对MC3T3-E1 细胞的保护作用，发现槲皮素能够减轻H2O2诱导的细胞凋亡和成骨分化功能障碍，这可能是通过Nrf2/HO-1 信号来实现的。