基于数据挖掘的重症肌无力动物模型应用分析

★ 徐添 官磊瑶 刘浪辉 王瑞奇 吴国艳 黄梅 黄春华（.江西中医药大学 南昌 330004；.江西中医药大学附属医院 南昌 330006）

重症肌无力（myasthenia gravis，MG） 是一种主要由乙酰胆碱受体（acetylcholine receptor，AChR）抗体介导，补体及多种因素参与的自身免疫性疾病［1］，病变主要累及神经肌肉接头突触后膜上的乙酰胆碱受体［2］。其全球患病率及病死率逐年升高，死亡原因包括呼吸衰竭和肺部感染，严重危害患者生命健康和生活质量［3］。目前MG 的治疗以胆碱酯酶抑制剂、糖皮质激素、免疫抑制剂、静脉注射免疫球蛋白、血浆置换以及胸腺切除为主［4-6］，这些方法虽然能缓解MG 症状，但长期使用可引起一系列不良反应［7］。因此，现代医学越来越关注与MG有关的动物实验研究，稳定可靠的动物模型是开展实验研究的基础和关键。本研究基于数据挖掘，通过检索MG 相关动物实验研究文献，对现有的造模要素进行归纳分析，以期为MG 实验研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 数据来源

以重症肌无力和动物模型为主题，检索CNKI、万方、维普、Sinomed、Pubmed 数据库，中文数据库检索时间为2001 年至今（共检索出相关文献490 篇）、外文数据库检索时间为2011 年—2021 年（共检索出相关文献243 篇）。

1.2 纳入与排除标准

选择MG 模型期刊文献，排除综述类、硕博论文、会议类及MG 体外实验文献等，共有137 篇文献符合标准。

1.3 统计学方法

将实验动物选择、造模方法、阳性药、检测指标等按照《实验动物和动物实验技术》［8］进行规范，并录入Excel 2019，采用频数分析进行统计归纳。

2 结果

2.1 MG 模型实验动物选择

将纳入的137 篇文献中所涉及的实验动物种类、性别、年龄及体重进行统计分析（部分文献未标注），MG 模型实验中动物：Lewis 大鼠，雌性，6～8 周龄，体重140～180 g；C57BL/6 小鼠，雌性，6～8 周龄，体重14～16 g；SD 大鼠，雄性，8～10 周龄，体重200～250 g。见表1。

表1 MG动物模型实验常用动物统计

2.2 MG 模型实验动物种类分布情况

将纳入的137 篇文献中的全部实验动物种类进行分类排序，共有13 类动物，累积频次137 次，其中2 篇文献中的动物未标种类，故在此不做统计。从分析结果可以看出MG 模型所用动物种类中，使用最多的为Lewis 大鼠（67 次，48.91%），其次为C57BL/6 小鼠（51 次，37.23%），SD 大鼠（5 次，3.65%），其他种类动物14 次。见图1。

图1 MG模型实验动物种类分布

2.3 MG 模型实验动物性别分布情况

将纳入的137 篇文献中所涉及的实验动物性别进行分类，共139 次，13 次未对动物性别做出标注，剩下的126 次中，雌性（107 次，84.92%），雄性（16 次，12.70%），雌雄各半（3 次，2.38%）。见图2。

图2 MG模型实验动物性别分布

2.4 MG 模型造模方法

在重症肌无力研究中，常用的动物模型主要有5 种［9-10］：（1）AChR 诱导的实验性自身免疫性重症肌无力（EAMG）模型，主要是电鳐AChR 诱导的EAMG 模型［11］和人工合成肽段诱导的EAMG模型［12］。（2）利用杂交瘤细胞株制备单克隆抗体建立被动转移模型；被动转移MG 患者或慢性EAMG 动物血清中的AChR-Ab；通过向实验动物脑室中注入MG 患者AChR-Ab 建立被动转移模型；被动转移AChRa 亚基单克隆抗体。（3）通过MG患者胸腺组织移植建立被动转移模型。（4）MuSK诱导的MG 模型［13］。（5）LRP4 诱导的MG 模型［14］。通过分析纳入的137 篇文献，其中电鳐AChR 诱导的EAMG 模型使用频次最高（57 次，41.61%），其次为人工合成肽段诱导EAMG 模型（41 次，29.93%）。见表2。

表2 MG动物模型分类

2.5 MG 模型阳性药

统计显示，MG 实验研究中阳性药的选择主要为强的松［15-16］，其次为溴吡斯的明［17-18］。

2.6 MG 造模成功标准

MG 造模成功标准主要通过以下几个方面进行评估：（1）临床表现变化，动物体重及肌力，精神状态、毛色、步态、日常活动、咀嚼摄食情况、呼吸频率等［19］；（2）行为学指标，游泳试验、抓握试验、悬吊试验等；（3）新斯的明试验；（4）AChR 抗体浓度及滴度检测；（5）电生理改变，低频重复电刺激的衰减率（RNS）、肌电图等；（6）病理形态学观察，骨骼肌神经肌肉接头处病理改变。

2.7 MG 模型相关检测指标

将纳入的137 篇文献中的全部检测指标进行分类排序，共涵盖16 种不同的指标类型，累积频数374 次。其中检测较多的指标为ELISA 法检测血清中的生化指标（94 次，25.13%），流式细胞仪分析脾脏和淋巴结、外周血、骨髓等组织细胞（57 次，15.24%），RT-PCR 检测相关基因包括脾脏和淋巴结、肌肉、胸腺等组织淋巴细胞总RNA及mRNA 的表达等（43 次，11.50%），Western Blotting 法检测相关蛋白包括脾脏和淋巴结、肌肉、胸腺等组织蛋白检测（26 次，6.95%），免疫荧光技术包括NMJ 处电生理、形态学和生物化学（26 次，6.95%）等。见表3。

表3 检测指标分类

94 篇ELISA 法检测血清中的生化指标累积频数132 次，其中较多的血清生化指标为AChR抗体水平（58 次，43.94%），细胞因子水平包括TGF-β、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10 和IL-17 等（24 次，18.18%），AChR IgG 抗体亚类包括IgG1、IgG2a、IgG2b 和IgG3 抗体（22 次，16.67%）等。见表4。

表4 ELISA 法检测血清中的生化指标分类

3 讨论

MG 主要表现为波动性无力和易疲劳性，晨轻暮重，活动后加重，休息后可减轻。全身骨骼肌均可受累，眼外肌最易受累，表现为对称或非对称性上睑下垂和复视，是MG 最常见的首发症状，见于80%以上的MG 患者［4,20］，其他还可导致面肌、咀嚼肌、颈肌，呼吸机等受累。发病早期可单独出现眼外肌、喉肌或肢体肌肉无力的症状，逐渐累及其他肌群，直到全身肌无力。部分患者短期内病情迅速进展，发生肌无力危象，危及生命［21］。MG 当属中医学“痿证”“痿躄”“睑废”“虚损”等范畴，《素问·痿论》曰：“五脏使人痿，何也？岐伯对曰：肺主身之皮毛，心主身之血脉，肝主身之筋膜，脾主身之肌肉，肾主身之骨髓，故肺热叶焦，则皮毛虚弱急薄，著发为痿躄也。”指出本病的主要病机是肺热叶焦，将痿证分为皮、脉、筋、骨、肉五痿，并提出“治痿独取阳明”的基本原则［21］，其治疗核心为补脾益气［16,23］。

目前治疗该病尚无特效药物，现有药物的长期使用常伴随一系列不良反应。随着MG 的发病率和死亡率逐年升高，人们对其关注也与日俱增，寻找一种更为安全有效的治疗药物或方案尤为重要。本文通过分析MG 相关动物实验研究发现，MG 模型常用动物为大鼠和小鼠，研究表明鼠的行为改变与人发病的表现最为相似，且已有相对成熟的技术对鼠进行转基因和基因敲除等处理，同时鼠较其他大型动物所需的免疫剂量更少，在造价、繁殖、操作等方面更具优势。MG 实验研究常选用Lewis 大鼠和C57BL/6 小鼠，Lewis 大鼠与人MG 表现最相像，且进展快、症状严重［9,25］；C57BL/6 小鼠对实验性自身免疫性重症肌无力的易感性较高，发病率在50%～70%［26-27］，其中大鼠较小鼠更易出现额外的急性反应期及更严重的肌无力症状。统计显示，在动物性别的选择上雌性较雄性更易诱发MG，EAMG 血清诱导可使雌鼠AChR 降低40%～50%，而雄鼠则无AChR 数量改变［9］。另外，在动物年龄和体重的选择上，6～8 周龄、体重140～180 g 的雌性Lewis 大鼠和6～8 周龄、体重14～16 g 的雌性C57BL/6 小鼠为较常用的MG 实验模型，体重决定自身抗体有效的胞外浓度，这是突触传递过程中的决定因素之一［28］。

本文统计发现使用最多的造模方法为AChR 诱导的EAMG 模型。AChR 诱导的EAMG 模型与人的发病进程相似，具有较高的可行性［9］。其不仅可以探索MG 的发病机制，也可以用于检测其他抗原的致病性，还可以用于评估降低自身抗体致病效应药物的治疗潜力［29］。但因该模型需要2～3 次增强免疫，对小鼠确定合适的时间窗预防和治疗MG 造成一定困难。其主要的造模方法包括电鳐AChR 和人工合成肽段诱导EAMG 模型［30-31］，电鳐AChR诱导EAMG 模型虽然可产生明显的肌无力症状，但AChR 提取困难且纯化过程涉及安全问题［32］。因此，近年来多选择人工合成肽段诱导EAMG 模型，与前者相比，其病程进展缓慢，临床表现复杂多样，更加有利于MG 发病机制和治疗药物的研究［33］。AChR-Ab 诱导的PTMG 模型直接将AChR-Ab 注入动物体内，其在抗体注射的48 h 内即可出现典型的肌无力症状［34］。但该方法不能检测靶向淋巴细胞及细胞因子表达或抗原识别的治疗剂量，也不会诱发慢性自身免疫性疾病［35］。其包括通过利用杂交瘤细胞株制备单克隆抗体建立PTMG 模型［29］，建模时间短，发病率高而易于评估，且避免了异质性，适合进行短期研究。被动转移MG 患者或慢性EAMG 鼠血清中的AChR-Ab，血清中存在各种免疫蛋白及炎症介质，干扰较大，不能保证单因素影响［36］。向实验动物脑室中注入MG 患者AChR-Ab建立被PTMG 模型，该方法步骤较复杂，对无菌条件及实验者的操作水平要求高，在实际操作中存在一定困难［37］。被动转移AChRa 亚基单克隆抗体，成模率较高，速度快，但临床症状消失快，不符合人类的患病特点［38］。其他还有MuSK 诱导的MG模型和LRP4 诱导的MG 模型等。

137 篇MG 实验研究文献中检测指标多为ELISA 法检测血清中的生化指标，流式细胞仪分析脾脏和淋巴结、外周血、骨髓等组织细胞，RT-PCR检测相关基因包括脾脏和淋巴结、肌肉、胸腺等组织淋巴细胞总RNA 及mRNA 的表达等，Western Blotting 法检测相关蛋白包括脾脏和淋巴结、肌肉、胸腺等组织蛋白检测，免疫荧光技术包括NMJ 处电生理、形态学和生物化学等。

MG 是一种罕见的自身免疫性疾病，其作用机制尚不明确，病理变化复杂多样。目前还没有能够完全替代涉及多组织和系统的复杂病理的动物模型［26］。在构建MG 实验模型时常选择6～8 周龄、体重140～180 g 的雌性Lewis 大鼠和6～8 周龄、体重14～16 g 的雌性C57BL/6 小鼠，采用电鳐AChR或人工合成肽段诱导的EAMG 模型。EAMG 模型不仅可以探索MG 的发病机制，也可以用于检测其他抗原的致病性，而且还可以用于评估降低自身抗体致病效应药物的治疗潜力。因此，EAMG 模型是研究发病机制和探索新疗法的重要工具。然而，与人类疾病相比，EAMG 模型的发病机制更加简单，因为它是在受控条件下繁殖的同基因动物身上进行的，特别是在遗传易感性和环境因素方面。