沙蚕蛋白酶高效降解变异新冠病毒S蛋白作用与S蛋白的生化特性分析

阚慕洁, 白若伦, 刘智奇, 白 宇, 王少华, 刘剑凯, 洪 敏*

(1)吉林大学基础医学院 生物化学教研室, 长春 130021;2)河北建材职业技术学院医院,河北 秦皇岛 066006;3)沈阳科奇医药技术开发有限公司, 沈阳 110000;4)吉林大学第一医院,病毒和艾滋病研究室, 长春 130021)

世界卫生组织(WHO)报告,至2023年9月,SARS-CoV-2简称新冠病毒-2(以下简称S-C-2)感染7亿余人,其中死亡人数接近7百万,是全世界过去3年最严重传染病。最早出现的病毒称为野生型(wild,以下称W-S-C-2),其后出现大量的突变株。WHO曾确定Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron为关切变异毒株(VOC),Lambda、Mu等为关注变异毒株(VOI)。野生型和Delta毒株曾造成大量感染和死亡。当前关切的毒株皆为Omicron的变异毒株,包括本研究中的BA.2、BF.7和XBB.1。

W-S-C-2是单股正链RNA病毒,长度为29 903个核苷酸,编码4种结构蛋白质,分别是刺突糖蛋白质(Spike glycoprotein,简称S,由1 273个氨基酸组成,pI为6.24);胞膜蛋白质(E);膜蛋白质(M);核衣壳蛋白(N)。S、E、M为病毒表面结构蛋白质,N为病毒内覆盖RNA基因组表面蛋白质[1-2]。

S蛋白是病毒感染宿主细胞主要致病因子,是抗体药物和疫苗的靶点[3];宿主细胞水解激活S蛋白的酶,则是一些小分子抑制剂药物的靶点。如抑制弗林酶(Furin)的M-1851、抑制跨膜丝氨酸蛋白酶-2(TMPRSS2 ,T-2)的M1-432,抑制组织蛋白酶L(cathepsin L, C-L)的E64d等[3-4]。但是由于病毒经常发生变异,S蛋白结构改变,可导致生物学等性质改变,如S蛋白密度、稳定性、可裂解性、S1蛋白脱离难易和膜融合性等变化[5-6],进一步引起抗体逃逸、免疫失效和致病性等变化[7-9]。因此,详细解析S蛋白的生物化学特性,可能更深刻认识新冠病毒的结构特性,也可能为抗新冠病毒研究,提供新的认知和途径。我们曾详细分析了野生型、5种VOC、2种VOI变异株S蛋白质的生物化学特征,其中碱性增强是突出变化,其次是不能被沙蚕碱性丝氨酸蛋白酶(alkaline serine protease fromNeanthesjaponica,ASPNJ,pI 4.4)裂解的突变赖氨酸(K)和精氨酸(R)增加。研究证实,ASPNJ可以高效地、相对特异性地降解野生型S蛋白质(W-S)[10]。但是目前流行的omicron变异株S蛋白的生物化学特性是什么,是否能被ASPNJ降解,ASPNJ是否能影响假病毒感染受体细胞,尚无资料可查。本文将提供这3个问题的初步研究结果。

1 材料与方法

1.1 材料

W-S-C-2、BA.2、BF.7、XBB.1的S蛋白购自上海惠诚生物公司、北京义翘神州生物公司或为上述公司的赠品。ASPNJ与其多克隆抗体是沈阳科奇生物技术有限公司产品。野生型假病毒(pseudovirus wild)系北京义翘生物技术公司产品。EV71肠道病毒和VP1抗体(肠道病毒结构蛋白抗体),是吉林大学第一医院病毒实验室实验品。

1.2 软件和数据库

https://www.uniprot.org/、https://web.expasy.org/compute_pi/、https://web.expasy.org/peptide_cutter/、https://outbreak.info/、Cov-Lineages,用来查阅变异病毒序列、预测和分析S蛋白及相关片段的等电点(pI)、可被ASPNJ裂解和不可裂解的肽键位点等数据。BA.2突变序列,见2022-07-22 outbreak.info,BF.7和XBB.1突变序列来自义翘产品介绍。

1.3 沙蚕碱性丝氨酸蛋白酶降解S蛋白反应

各株病毒S蛋白依据样品说明书稀释溶解、ASPNJ溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中。反应总体积为20 μL,其中含10 μg S蛋白,不同含量的ASPNJ(1、0.2、0.04、0.008、0.0016 μg),对照ASPNJ为30～100 μg。S蛋白质浓度为0.5 mg/mL,5个反应管中ASPNJ浓度,分别为50 μg/mL、10 μg/mL、2 μg/mL、0.4 μg/mL、0.08 μg/mL。对照ASPNJ浓度为1.5～5 mg/mL。反应37 ℃ 1 h,反应终止后加入5 μL上样缓冲液,100 ℃变性2 min,常规不连续12% SDS-PAGE电泳,考马斯亮蓝R25染色。

1.4 沙蚕碱性丝氨酸蛋白酶对假病毒感染受体细胞分析

参考抗体中和实验程序,由试剂公司协助完成。实验在96孔培养板上进行,每孔依次加入50 μL假病毒、生理盐水稀释的不同浓度ASPNJ10 μL,37 ℃度孵育1 h,加入抗ASPNJ多克隆抗体40 μL(40 μg),37 ℃度孵育1 h,加入过表达ACE2的293T-ACE2细胞150 μL,再孵育72 h。孵育结束时拍照片,检测荧光素酶(luciferase)发光值(RLU),抑制率=1-(样本RLU-阴性对照RLU)/(阳性对照RLU-阴性对照RLU)。ASPNJ影响病毒感染细胞的对照实验,在96孔板上进行,程序同上。对照病毒是肠道RNA病毒EV71,感染人胚胎恶性横纹肌瘤(human rhabdomyosarcoma, RD)细胞,观察细胞致病变效应(CPE)、蛋白质印迹实验(WB)检测病毒结构蛋白质(VP1)的表达情况。

为了直观了解实验中4种病毒S蛋白质的异同和讨论研究结果,根据文献将其结构展示在Fig.1中。

Fig.1 Diagram of the primary structure of the S protein of wild type and BA.2, BF.7, XBB.1 SARS-COV-2 From left to right (from the N to the C terminal) of the proteins are the signal peptide, S1 protein, S2 proteins, respectively. The protein length is indicated by aa number. The C terminal sequence(-RRAR)of the S1 protein is a motif CendR, which can recognize, bind and activate the neuropil receptors(NRP1 and NRP2). In the middle of the S1 protein is the RBD segment. There are two fusion peptides in the S2 protein. The K or R and number in bracket are the number of lysine or arginine residues in that protein fragment

2 结果

2.1 野生型与BA.2、BF.7和XBB.1的S蛋白生物化学特性分析

3种新冠病毒S蛋白中突变氨基酸的位置和序列如下,左起第1个中括号内是S1中的突变氨基酸,其中,下划线是RBD中突变的氨基酸,第2个中括号内是S2中突变的氨基酸。T478K、Q498R、N440K是突变后产生的不能被ASPNJ裂解的K或R残基,其余K和R均是可以被裂解的残基。

BA.2:【T19I、L24S、del25/27、G142D、V213G、ins214(EPE)、G339D、S371F、S373P、S375F、T376A、D405N、R408S、K417N、N440K、S477N、T478K、E484A、Q493R、Q498R、N501Y、Y505H、D614G、H655Y、N679K、P681H】、【N764K、D796Y、Q954H、N969K】

BF.7:【T19I、del24-26、A27S、del69-70、G142D、V213G、G339D、R346T、S371F、S373P、S375F、T376A、D405N、R408S、K417N、N440K、L452R、S477N、T478K、E484A、F486V、Q498R、N501Y、Y505H、D614G、H655Y、N679K、P681H】、【N764K、D796Y、F817P、A892P、A899P、A942P、Q954H、N969K、K986P、V987P】

XBB.1 S:【T19I、del24-26、A27S、V83A、G142D、del145Y、H146Q、Q183E、V213E、G252V、G339H、R346T、L368I、S371F、S373P、S375F、T376A、D405N、R408S、K417N、 N440K、V445P、G446S、N460K、S477N、T478K、E484A、F486S、F490S、Q498R、N501Y、Y505H、D614G、H655Y、N679K、P681H】、【N764K、D796Y、F817P、A892P、A899P 、A942P、Q954H、N969K、K986P、V987P】

本文用软件分析了W-S、BA.2、BF.7和XBB.1的S、S1、S2、RBD、CendR、FP蛋白质或肽的aa长度、pI、K和R的数量、可被ASPNJ裂解的K和R位点和数量、不能被ASPNJ裂解的K和R位点和数量,汇总在Table 1中。与W-S比较,变化明显的参数是,突变型S的pI升高,尤其是S1和RBD;K和R在S中比例增加;不能被ASPNJ裂解的K和R略有增多。上述变化主要发生在S1中,S2变化不大。其余参数总体变化不大或相同,见Table 1。

2.2 野生型和部分变异株S蛋白的furin酶位点多肽及TMPRSS2酶位点多肽氨基酸序列比对分析

ASPNJ降解不同肽段中K和R,对病毒进入细胞途径影响不同。本文分析了Furin酶裂解位点多肽和TMPRSS2酶裂解点多肽,其序列见Table 2。

序列比对显示,这2个酶水解位点附近的氨基酸均是较保守的。Furin酶裂解S产生S1-CendR,此模序与NRP1和NRP2受体结合,通过膜融合,病毒感染受体细胞;TMPRSS2裂解815R,暴露FP,融合ACE2,病毒进入细胞。这2个区域的高度保守性,说明病毒虽然变异,但其感染途径是相同的。

Table 1 Comparison of biochemical characteristic and degradation prediction of wild type and 3 omicron mutant S proteins by ASPNJ

2.3 沙蚕碱性丝氨酸蛋白酶高效降解野生型和omicron突变型新冠病毒S蛋白

结果显示,ASPNJ可以高效降解S蛋白质:A4(8 ng)可以使10 μg 野生型S蛋白彻底降解(质量比1∶1 250);对BA.2、XBB、BF.7虽然未完全彻底降解,但是全部的BA.2-S和大部分的XBB-S及BF.7-S蛋白被降解,失去完整结构,裂解成大小不一的片段。再者,BA.2-S蛋白对其更敏感,A5(1.6 ng)可使其全部失去完整结构(质量比1∶6 250)。ASPNJ浓度越高,降解作用越强,直至彻底降解(见Fig.2)。

Fig.2 Degradation of wild type and omicron variant SARS-CoV-2 S proteins by ASPNJ (A) Degradation of W-S, (B) Degradation of BA.2-S; (C) Degradation of BF.7-S; (D) Degradation of XBB.1- S. The quantity of S was 10 μg/lane. M: molecular marker, unit: kD. The wild type S was labeled as S, BA.2 as B2, BF.7 as B7, XBB.1 as X1, respectively. AC was the control ASPNJ, the quantity was 30-100 μg, A1 was 1 μg/lane, A2 was 0.2 μg/lane, A3 was 0.04 μg/lane, A4 was 8ng/lane, A5 was 1.6 ng/lane, respectively

2.4 初步结果显示假野生新冠病毒被ASPNJ处理后,其感染293T-ACE2细胞的作用有降低趋势

各个孔中ASPNJ浓度(质量/mL)与抑制率关系如下,51.2 pg/mL(0.64%)、256 pg/mL(36.02%)、1.28 ng(39.29%)、6.4 ng/mL(40.02%)、32 ng/ mL(58.9%)。结果显示,假野生病毒受ASPNJ影响,其感染受体细胞的作用,有降低趋势。

对照实验证明,ASPNJ在上述浓度以及更高的浓度4 μg/mL,不能抑制肠道病毒EV-A71(enterovirus A71)的感染与复制,加入ASPNJ后并不能使人横纹肌肉瘤RD细胞(human rhabdomyosarcoma)的致细胞病变效应CPE(cytopathic effect)减少;同时病毒的结构蛋白VP1的表达未见明显减少,细胞的形态学未见发生明显改变。

3 讨论

突变型S主要生化改变及ASPNJ的高效降解作用。与野生型比较,3种突变型S蛋白的碱性明显增高,尤其是S1和RBD结构域;K和R在S蛋白质中占比量增多;不能被降解的K和R少量增加;这是主要的生化改变(见Table 1)。盐键和极性键是RBD与ACE2结合的主要化学键[11],野生型RBD为223 aa,pI是8.91;宿主ACE2为805 aa,pI是5.36,而3个突变株的RBD的pI均超过9以上,这些变化可能增强变异毒株与ACE2的结合。ASPNJ降解S蛋白实验结果显示,ASPNJ依然能高效降解突变株-S,其强度比降解W-S稍低,其原因可能与突变株-S中增加了几个不能被降解的R和K有关。SARS-CoV2的S蛋白是三聚体结构,未结合ACE2前,部分三聚体呈现1-2个RBD竖立表面的开放式构象。RBD逐步结合ACE2受体后,启动膜融合[12]。在自然状态下,病毒S1和RBD可能很容易受外在因素的影响。信息分析显示,病毒基因组进入细胞的2个主要途径,都可能因ASPNJ降解S蛋白而被破坏。

病毒感染进入细胞有2种主要途径。其一是膜融合进入途径(membrane fusion entry):当病毒黏附在易感组织细胞表面时,病毒RBD直接与ACE2结合,弗林酶(Furin,794 aa)识别S蛋白的682RRAR序列,并在685R↓处裂解成S1和S2两个蛋白质。宿主细胞跨膜丝氨酸蛋白酶-2(T-2,TMPRSS-2,492 aa,)裂解S2的815R↓,产生S2′。S2′的N端816～837肽段和835～855肽段,为2个融合肽(FP, fusion peptide),参见Fig.1。FP融合并裂解ACE2,病毒基因组RNA进入宿主细胞[13-15]。病毒感染还有另外一种膜融合途径,S1蛋白的Cend(682RRAR)识别、结合、激活嗅神经细胞、呼吸道黏膜细胞表面神经纤毛蛋白受体(NRP1,neuropilin receptors,923 aa)、NRP2(931 aa),病毒基因组RNA进入宿主细胞[16-17]。另一种是内体进入途径(endosomal entry)。在TMPRSS2表达不充分的细胞,或病毒-ACE2复合物未遇到TMPRSS2,病毒ACE2经过胞膜内吞进入细胞,在酸性环境下,组织蛋白酶L(cathepsin L)裂解S2,产生S2′蛋白质,将病毒表膜与内体质膜融合,病毒基因组RNA进入宿主细胞质[18-19]。

ASPNJ是从渤海湾生长的日本刺沙蚕提取的一种碱性丝氨酸蛋白酶(pI是4.4)、分子量接近30 kD,用生色底物S-2238、S-2444和 S-2251的酰胺键水解实验证实,该酶水解蛋白质中K和R残基的C端肽键[20]。催化性质类似胰蛋白酶(trypsin),因此,用软件分析ASPNJ对S蛋白的裂解时,采用胰蛋白酶作对照。作者在研究ASPNJ降解W-S实验时,比较了两者的活性,ASPNJ活性至少大于胰蛋白酶300倍以上[10]。ASPNJ对RBD的降解作用,破坏了病毒与宿主细胞膜的结合。无论野生型还是突变型的RBD中都含有20多个可裂解的K和R残基,不能被裂解的K和R只是少数,详见Table 1。因此,ASPNJ降解RBD,使病毒不能再与ACE2结合。S1的C末端模序(CendR)中的3个R,均可以被ASPNJ降解。CendR被破坏后,病毒不能结合宿主细胞膜上的NRP1和NRP2受体,因此,使其失去这种膜结合途径。再者,3个omicron变异株的674K、675K、676K也可以被降解,同样也破坏了CendR结构(Table 2)。ASPNJ对S蛋白质的T-2裂解位点临近序列的降解,既破坏了S2′的形成,也破坏了FP的结构。以野生型为例,T-2815R↓位点的临近序列(808～837aa)也是高度保守的,甚至SARS-CoV-S也相似。此中816S,对T-2识别位点和裂解位点是必不可少的[4][21]。FP中825K、835K均可裂解,因此,S2′失去融合裂解ACE2的功能,病毒基因组RNA不能进入宿主细胞(详见Table 2)。

综上所述,理论上ASPNJ可以裂解S蛋白质中绝大部分R和K,使RBD不能结合ACE2、S1不能结合NRP1和NRP2、FP不能融合裂解ACE2。ASPNJ既能破坏了膜融合途径,也破坏了内吞进入途径,而且这种作用具有广谱性。

ASPNJ对W- S假病毒感染293T-ACE2的影响。假病毒模型依然有效地用于抗体药物评价和筛选等研究[22-23]。本文研究的目的,是观察被ASPNJ处理后的假病毒感染受体细胞的情况。结果显示,处理后的假病毒感染受体细胞作用有所降低。分析其作用机制可能与ASPNJ降解假病毒细胞表面S蛋白有关。而对照实验显示,ASPNJ未显示出抗肠道病毒EV-71的作用。当然该实验仅是初步研究,仍需要更多实验来验证其作用,例如ASPNJ处理后分离假病毒方法的优化、对新冠病毒作用的广谱性等。有研究证实,胰蛋白酶能灭活SARS-CoV假病毒。早在2011年,在研究宿主的不同蛋白酶激活SARS-CoV S蛋白质实验中,感染293T-ACE2细胞前,用胰蛋白酶(0.01～10 μg/mL)处理假病毒,3～10 μg/mL能使野生型假病毒和含有K672L突变的假病毒感染性显著降低,3 μg/mL以下至0.1 μg/mL灭活作用显著降低,直到几乎无作用;对野生型假病毒,血纤维蛋白溶解酶(plasmin)、食糜蛋白酶(chymotrypsin)、嗜热菌蛋白酶(thermolysin)等有同样作用,但是对R667A突变株无作用,S蛋白的667R是最容易被胰蛋白酶降解的位点[24]。667R应该是最易降解的位点,但不是唯一的降解点,理论上应该有93个胰蛋白酶裂解点,对假病毒是激活还是灭活显然与剂量有关。在培养基中,胰蛋白酶通过促进病毒进入受体细胞的方式,增加了SARS-CoV-2的感染性。2022年一个研究显示,当受体Vero E6细胞先用1 MOI(multiplicity of infection,感染复数)的SARS-CoV-2感染1 h,然后用无血清但是含有不同浓度胰蛋白酶的培养基(0,1.25,2.5,5,10 μg/mL)进行培养,感染24 h,再测上清滴度。结果显示,2.5～10 μg/mL组,其滴度比低浓度组或无胰蛋白酶组的滴度要高,细胞病变效应更明显,因此提出,胰蛋白酶促进了假病毒的感染[25]。2020年一个报告显示,在培养基中,加入胰蛋白酶促进了HEK-293T 细胞与293/hACE2细胞融合。形态学和定量的荧光素酶分析都表明,合胞体明显增多[26]。这些研究显示,胰蛋白酶对病毒活性的影响,可能与作用途径、剂量以及作用时间有关[24-26]。

值得关注的是T-2不仅能降解S蛋白质,也能降解ACE2。2014年一篇文献显示,ACE2的697～716肽段中的R和K(697RTEVE702KAI705RM S708RS710RINDAF716R)被T-2裂解后,可增加SARS-CoV进入宿主细胞,并且是进入细胞的重要条件[27]。2020年一篇文献报告[4],T-2在SARS-CoV-2-S蛋白中的裂解位点的aa序列是K815R↓S(详见Table 2),但是ACE2中未见KRS序列,T-2却可以将其降解。由此可见,准确定位T-2在ACE2中的识别序列与裂解位点和分析其作用,可能仍需要做更多的研究工作。

总之,本文通过软件预测分析表明,3株变异病毒S蛋白碱性增强,S1和RBD更明显、不能被ASPNJ裂解的碱性氨基酸K和R略有增加,其余生化性质,与wild型类似;还预测了ASPNJ对不同肽段K和R的降解对病毒活性的影响。研究证实,ASPNJ同样可以高效降解这几种变异新冠病毒的S蛋白质;初步研究显示,ASPNJ可能有抑制野生型假病毒感染细胞作用,但确切结论,仍有待更多实验证实。本文结果可能为研究新冠病毒提供一个新的工具酶和新的思路。