民族理筋手法对大鼠运动性骨骼肌损伤血清标志物影响的研究

李彦双，马惠昇，穆 静，史 欢，李嫚嫚，桑 涛，宋毛毛

（宁夏医科大学中医学院，宁夏 银川750004）

运动性骨骼肌损伤（Exercise-induced muscle damage，EIMD）是指机体维持或长期从事不习惯、高强度运动后发生的骨骼肌纤维微细损伤，常发生在离心运动后［1］。机体在大负荷高强度的离心运动后，骨骼肌纤维会产生超细微结构改变，导致肌细胞膜损伤。血清肌酸激酶（Creatine kinase，CK）和乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase，LDH）等肌肉蛋白酶因为运动导致的骨骼肌细胞膜损伤，使膜通透性增大而由细胞内进入血液。所以这些肌肉蛋白酶在血液中浓度增加意味着骨骼肌细胞膜损伤或通透性增加，间接提示肌肉存在某种程度的损伤。EIMD 是骨骼肌结构和机能重建、提高机体运动能力的必要过程，但延迟性的损伤会造成不同程度的肌肉酸痛、运动能力下降及运动性疲劳等多种问题，若不及时治疗，将进一步加剧运动损伤并造成慢性疼痛或损伤。因此，如何在骨骼肌损伤发生后找到一种较为快捷有效的治疗手段，防治骨骼肌损伤后继续恶化，提高肌肉损伤的

治愈率，缩短痊愈时间已经成为广泛关注的问题。课题组前期经过大量临床及实验研究证实，回族理筋手法可疏通经络、消肿止痛、放松肌肉、滑利关节，在骨骼肌损伤康复治疗方面具有独特疗效［2-3］。本实验拟通过理筋手法对大鼠骨骼肌运动性损伤后局部温度、血清肌酸激酶同工酶（Creatine kinase isoenzyme，CK-MM）、乳酸脱氢酶及肌红蛋白（myoglobin，Mb）含量变化的研究，观察回族理筋手法对运动性骨骼肌损伤的治疗效果。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 SPF 级健康雄性SD 大鼠63 只，8周龄，体质量（200±20）g，由宁夏医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（宁）2015-0001。饲养环境维持温度23 ℃～25 ℃，湿度55%～60%，每小时换风16 次，12 h 光照/12 h 黑暗自动控制循环光照条件。

1.1.2 试剂与仪器 血清CK、LDH 及Mb 试剂盒购于武汉基因美生物科技有限公司。红外线热成像仪，美国Meditherm 公司，型号MED2000IRIS7；酶标仪，芬兰Labsystems Multiskan MS 公司产品，型号352 型；洗板机，芬兰Thermo Labsystems 公司产品，型号AC-8；国产微量高速离心机，型号TG16W；吉尔森P 型移液器（Pipetman）；隔水式恒温培养箱，型号GNP-9080。

1.2 实验方法

1.2.1 分组与处理 63 只SD 雄性大鼠适应性喂养5 d 后，随机分为空白组、模型对照组、自然恢复组、治疗组。空白组18 只正常饲养，不做任何处理，分别于造模结束后的第1 周末、第2 周末各处死9 只；模型对照组、自然恢复组和治疗组均按照下述造模方法进行造模。模型对照组9 只于造模4 周结束后处死；自然恢复组18 只造模结束后不予任何干预手段，分别于造模结束后的第1 周末、第2 周末各处死9 只；治疗组18 只造模结束后给予回族理筋手法治疗，1 次/d，5～8 min/次，5 次/周，分别治疗1 周、2 周后各处死9 只。每组大鼠在处死前均先在股四头肌处拍摄红外热图像并记录下损伤局部温度。

1.2.2 模型制备 在正式实验前除空白组外，其余各组大鼠均在跑台上进行2 d 适应性训练：第1 天跑台坡度0°，16 m/min，持续10 min；第2 天跑台坡度0°，19 m/min，持续20 min。在适应训练后间歇休息1 d，次日开始正式实验。参照Armstrong RB等［4］的造模方法，模型组、自然恢复组和治疗组大鼠均运用一次性跑台建立运动性骨骼肌损伤模型，进行一次性持续下坡跑运动，具体的参数是：跑台坡度-16°，速度19 m/min，运动持续时间120 min，120 min/d，5 天/周，共4 周。

1.2.3 回族理筋手法 根据《回回药方》第34 卷“折伤门”筋伤相关理论，以及目前回族医学临床治疗“慢性筋痛症”使用频率较高的常用手法，选取松筋、拨筋、顺筋法3 种理筋手法。每天由专人操作，将大鼠固定于固定器上，在大鼠的股四头肌处分别施以松筋、拨筋、顺筋法。松筋：左手固定大鼠头颈部，用右手拇指指腹自髂前下棘至胫骨粗隆之间进行轻柔有频率地来回按揉，时间约为3 min。拨筋：用右手的拇指指腹与中、食指指腹进行操作，用中、食指固定辅助腿部，拇指指腹在股四头肌处进行轻柔有频率地横向拨筋，时间为3 min。顺筋：以右手拇指着力于股四头肌处，顺着肌肉的走向和经筋的循行进行有节律地推捋，时间2 min。

1.3 观察指标

1.3.1 医用红外线热成像仪检查 采用医用红外线热成像仪，结合Meditherm IRIS 7.5，Meditherm Display 软件及计算机对图片进行存储及相关区域温度测定和校对。该系统空间分辨率为1 mrd，测温参数范围为0～50°，在无空气对流、无阳光直射的房间进行图像采集，室温设置在21 ℃左右，湿度为50%～60%。每组实验动物在拍摄前用剃毛机剃除股四头肌处毛发，充分暴露皮肤，不可损伤皮肤，安静休息10 min；随后用大鼠固定器固定大鼠，充分暴露无毛部分之后，使其距红外线热成像仪镜头1.5 m 处采集图像信息，并记录下图像的红色区域及白色区域的平均温度。

1.3.2 标本采集 将大鼠称重后，用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，用心尖采血的方法收集血液5 mL 于离心管中，将血样离心（4 ℃，3000 r/min，10 min）分离血清，取血清于Appendorf 管中，冷冻于-80 ℃冰箱中备用。采用酶联免疫法检测大鼠血清CK-MM、LDH、Mb 水平，实验过程严格按照试剂盒上的说明方法进行。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0 统计软件对实验数据进行分析处理，结果以均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-T检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

各组大鼠温度及血清CK-MM、LDH、Mb 含量的比较见表1。从表1 可以看出，造模4 周结束后，模型对照组损伤局部温度、血清CK-MM、LDH、Mb 水平均上升（P＜0.01）；治疗组行回族理筋手法治疗1 周后，各指标都有所降低P＜0.05）；自然恢复1 周组LDH 水平较模型组降低（P＜0.05），其他3 项指标无明显变化（P＞0.05）；治疗1 周组CKMM 与LDH 水平较自然恢复1 周组明显下降（P＜0.05）；而治疗2 周组除LDH 外，其余3 项指标均较自然恢复2 周组明显下降（P＜0.05）。

3 讨 论

3.1 回族理筋手法与大鼠骨骼肌损伤后局部温度变化之间的关系

目前，红外热成像技术在临床应用较为广泛。红外线热成像系统是以多数疾病都可以引起温度场变化为依据，通过检测身体表面温度的差异，用可视化图片来体现，再利用专属计算机对信号进行分析与解读，以机体不同部位的温度来评估人体的寒热变化。该技术具有测温迅速、准确、客观、灵敏的优点，且无痛苦，无刺激，无辐射，患者易于接受［5］，在临床上对炎症、肿瘤、周围神经疾病及一些疑难病症可做提示性诊断。本研究成功将该技术运用于动物实验中，并为慢性运动性骨骼肌损伤模型的建立提供辅助性诊断。实验结果表明，大鼠4 周跑台造模结束后，选取股四头肌处拍摄红外热像，该部位温度明显升高，说明经长期慢性运动后，大鼠股四头肌处组织细胞结构或功能改变引发无菌性炎症，导致局部被炎性物质浸润，血流速度加快，局部温度升高。

温度是反应机体生理病理状态的重要参数之一，红外线热成像技术可将病变组织与正常组织之间出现的温差变化体现出来，从而为局部肌肉损伤提供间接性诊断。根据红外线热成像系统的皮温测定结果，本实验除空白组外，其余各组大鼠股四头肌处温度明显升高。治疗组施以回族理筋手法作用于股四头肌处，在治疗1 周、2 周后，股四头肌处体表温度明显低于自然恢复组（P＜0.05），说明手法有助于促进局部无菌性炎症的消退，改善局部血液循环，从而降低体表温度。

3.2 回族理筋手法与大鼠血清损伤标志物之间的关系

机体中酶类多在细胞内合成，当骨骼肌发生微损伤时，细胞膜通透性改变，肌细胞中各种酶类入血，致使血清中酶活性升高，产生一系列化学效应，刺激神经末梢产生疼痛［6］。

肌酸激酶是血浆非功能性酶的一种，是由2个亚单位组成的二聚体，CK-MB 主要存在于心肌中，CK-MM 主要存在于骨骼肌中［7］。在骨骼肌中，CK 基因的表达大多是以CK-MM 形式存在的，其组织特异性较CK 能更准确地反映骨骼肌的机能状态［8］。有研究发现，大运动耐力训练后大鼠血清CK-MM 显著增加，与正常组比较差异有统计学意义（P＜0.05）［9］。王瑛等［6］在对一次性力竭运动大鼠模型血清CK-MM 含量变化的研究中发现，模型组大鼠血清CK-MM 值持续上升，峰值出现在73 h，说明运动诱发骨骼肌损伤，致CK-MM 释放入血，血中CK-MM 活性升高。刘沛洁等［10］通过4 周下坡跑建立慢性EIMD 大鼠模型，造模4 周后，大鼠血清CK-MM 含量显著上升，在4 周造模结束后推拿组即刻给予推拿干预，CK-MM 值随着恢复时间的延长而下降。本研究结果显示，在慢性持续性下坡跑运动4 周时，模型对照组大鼠血清CK-MM 值明显上升，说明长期的慢性运动已引起大鼠骨骼肌的损伤。治疗组通过回族理筋手法治疗1 周后，血清CK-MM 含量较自然恢复1 周组下降明显；手法治疗2 周，血清CK-MM 恢复至正常水平。说明回族理筋手法干预可以下调血清中CK-MM 的表达，同时能够促进损伤肌组织的修复，并对骨骼肌运动机能起到一定的保护作用。

表1 各组大鼠温度及血清CK-MM、LDH、Mb 含量的比较 （±s）

表1 各组大鼠温度及血清CK-MM、LDH、Mb 含量的比较 （±s）

注：与空白组比较，1）P＜0.01；与模型对照组比较，2）P＜0.05；与自然恢复1 周组比较，3）P＜0.05；与自然恢复2 周组比较，4）P＜0.05

组别 n T（℃） CK-MM（ng/mL） LDH（ng/mL） Mb（pg/mL）空白1 周组 9 32.70±0.48 12.833±1.494 65.943±6.136 2886.426±140.681空白2 周组 9 32.68±0.50 13.074±1.858 64.172±5.929 2814.839±222.786模型对照组 9 34.71±0.431） 27.476±4.0481） 120.906±9.5871） 4472.034±526.4801）自然恢复1 周组 9 34.52±0.44 23.699±3.627 101.878±8.8852） 4064.570±246.318自然恢复2 周组 9 34.08±0.33 17.564±1.777 62.201±5.511 3108.083±205.009治疗1 周组 9 34.27±0.352） 18.553±1.5042）3） 84.050±13.4522）3） 3854.715±190.5982）治疗2 周组 9 33.67±0.442）4） 14.287±1.5882）4） 64.916±6.5762） 2844.253±279.0902）4）

乳酸脱氢酶（LDH）主要分布于心肌、骨骼肌、肝脏细胞中，是机体糖无氧代谢途径的一种重要酶，为机体在缺氧状态下运动时提供能量。当骨骼肌发生损伤时LDH 从细胞内溢出组织间液再进入血液，从而导致血清酶活性增加［11］。CK 和LDH 常用来评价运动性肌损伤时骨骼肌细胞膜通透性的改变。有研究显示，持续时间离心运动后，大鼠血清LDH 的含量显著上升［12］。马新东等［13］通过一次性离心运动来观察大鼠骨骼肌骨架蛋白的表达，发现运动后大鼠血清CK、LDH 浓度即刻显著增加。本研究结果显示，在慢性运动性骨骼肌损伤的过程中，大鼠血清LDH 水平显著升高，与自然恢复1 周组比较，治疗组经回族理筋手法治疗1 周后，血清LDH 明显下降（P＜0.05），说明运动结束后大鼠血清LDH 的变化随着时间的增长逐渐下降，治疗组在回族理筋手法的干预下，大鼠血清LDH 下降明显，说明回族理筋手法可以抑制机体无氧代谢的进程，加快血清LDH 恢复至正常水平，从而促进骨骼肌损伤的修复。

Mb 主要存在于肌组织的肌浆中，含量约为0.2%～2%，是肌细胞中储存氧的蛋白质。在持续性运动中会产生大量自由基，自由基的攻击会使得肌细胞膜通透性增加，而Mb 的分子量较小，约为17.5kD，容易通过肌细胞膜进入血液中。大量研究表明，当运动引起的骨骼肌微损伤时，血中Mb 会显著升高。李扬［14］研究发现，在大强度运动后，血清Mb 浓度随着时间不断增高，在24 h～48 h 之间增长幅度骤然增加，48 h 时达到峰值，此后逐渐恢复，但变化不明显。而狄媛［15］发现在高强度运动中，运动员血清Mb 的最高值出现在运动后24 h。本实验研究结果发现，在持续性4 周下坡跑运动结束后，模型组大鼠Mb 含量显著上升，这是由于长期的运动损伤致使机体内自由基产生过多，导致肌细胞膜的通透性增加，Mb 通过肌细胞膜进入血液循环中，进而使得血清中Mb 含量增加。治疗1 周组血清Mb 水平较自然恢复1 周组下降明显，但Mb 水平仍高于正常；治疗2 周后，恢复至正常水平，与自然恢复2 周组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。说明回族理筋手法可以抑制骨骼肌损伤过程中自由基的产生，使得肌细胞膜的通透性保持在正常状态，因此血清中Mb 的含量会明显下降。以上研究结果表明回族理筋手法可能通过调节外周血清标志物CK-MM、LDH 及Mb 的水平而降低受损肌组织的体表温度。