低强度激光修复术对小型巴马猪退变椎间盘水通道蛋白-3表达的影响*

黄 明 孙莹杰△ 张铁铮 李 凯 郑昊龙 何宝文 陈克研

(1沈阳军区总医院麻醉科，沈阳 110016；2沈阳市第四人民医院麻醉科，沈阳110031)

低强度激光修复术对小型巴马猪退变椎间盘水通道蛋白-3表达的影响*

黄 明1#孙莹杰1#△张铁铮1李 凯2郑昊龙1何宝文1陈克研1

(1沈阳军区总医院麻醉科，沈阳 110016；2沈阳市第四人民医院麻醉科，沈阳110031)

目的：通过构建小型巴马猪椎间盘退行性病变模型，观察低强度激光对猪椎间盘水通道蛋白-3(Aquaporin-3，AQP-3) 表达的影响。方法：小型巴马猪9头，随机分为对照组 (Con组)，造模组 (Mod组)及激光治疗组 (Las组)，每组3头。Con组不进行任何处理，Mod组及Las组在C形臂X光引导下利用16G针刺入猪L2-3、L3-4、L4-5、L5-6椎间盘进行破坏，Las组猪椎间盘退变模型建立1个月后，对已处理的椎间盘进行低能量激光治疗再观察1个月，进行MR检测，并取椎间盘HE染色、免疫组化及Western检测AQP-3的表达情况。结果：三组在造模前、造模后1个月、治疗后1个月，Con组猪的椎间盘T2加权像呈高信号，Mod组信号强度明显下降，Las治疗组呈中、高信号影。HE染色Con组结构完整，Mod组结构遭到破坏，Las组结构较Mod组显著恢复。与Con组比较，Mod组和Las组猪椎间盘的AQP-3表达均显著降低 (P ＜ 0.05)，而Las组AQP-3表达较Mod组显著升高，差异有统计学意义(P ＜ 0.05)。结论：低强度激光对小型巴马猪退变的椎间盘具有保护作用，其机制可能与上调其间盘组织水通道蛋白表达有关。

强度激光；椎间盘退化；巴马猪；水通道蛋白-3

椎间盘突出是一个漫长的病理过程，椎间盘主要由纤维环、髓核以及上下终板构成，其中髓核被富含水分的纤维环所包绕，髓核含水量较纤维环高，其髓核含水量约80%，纤维环含水量约为 65%。腰椎间盘退变的发生与发展是人体在生长发育停止后开始，多于25岁左右，纤维环与髓核相继发生退变，髓核脱水及吸水功能减弱，体积减小，弹性下降，椎间盘内压力变化不均，导致软骨终板损伤，导致椎间盘营养改变，椎间盘组织细胞成分改变，加速椎间盘退变，椎间盘退变导致纤维环出现裂痕，中央的髓核在受到周围的压力，在最薄弱处膨出、突出甚至脱出。

既往的研究显示水通道蛋白-3 (Aquaporin-3，AQP-3) 与椎间盘退变有明显的相关性[1～3]，AQP-3在椎间盘的生理代谢过程中具有重要的作用，可维持正常的渗透压及能量的合成，参与维持椎间盘细胞的正常形态以及能量代谢[4,5]，本文通过构建小型巴马猪椎间盘退行性病变动物模型,探讨低强度激光修复术对猪椎间盘退行性病变的作用及其水通道蛋白-3表达的影响，为低能激光技术用于治疗椎间盘突出疾病，提供可靠的实验依据。

方 法

1.动物分组

健康成年小型巴马猪9头，雌雄不限，体重50～60 kg，由沈阳军区总医院医学实验动物科提供。按照随机数字表法，将上述巴马猪随机分为3组，每组3头，分别为空白对照组 (Con组)，造模组 (Mod组)和低能量激光治疗组 (Las组)。Con组不进行任何处理，进行观察2个月，Mod组建立猪椎间盘退变模型后再观察2个月，Las组建立猪椎间盘退变模型观察1个月进行低能量激光治疗，再观察1个月。

2.模型的建立及处理

术前取耳缘静脉穿刺建立静脉通路，静脉给予3 mg/kg丙泊酚实施麻醉。麻醉成功后，将小型巴马猪以左侧位躺卧在具有C形臂X线引导的手术台上，持续泵入丙泊酚8 ml/h维持麻醉，术中监测生命体征。术中静脉输注生理盐水，并给与160万单位青霉素预防感染。

参照文献[6]报告的方法建立椎间盘退行性变模型。在C形臂X线引导下确定猪L2-3、L3-4、L4-5、L5-6椎间隙，用1%的利多卡因进行浸润麻醉，用16 G的引导针沿定位点穿刺椎间盘。穿透纤维环后侧后，呈放散状将椎间盘进行针刺破坏。术后连续应用3天青霉素80万单位，每日观察大小便以及饮食情况，1周后去除敷料，术后1个月行MR检测验证模型是否成功。

在造模成功1个月后，对造模的椎间盘进行低强度激光治疗。C形臂X线引导下确定针尖位置无误后，沿着引导针向椎间盘中间导入直穿刺针。向穿刺针中导入外径为400 μm的光纤，光纤连于激光设备，设置激光器功率3瓦，预设能量900焦耳。激光辐射时间（曝光时间）30秒。波长λ = 970 nm (0.97 μm)的激光辐射强度为3 W。辐射能量为90焦耳。激光作用后，注入少量(0.2～0.5 ml)生理盐水。借助影像确定弯头针的位置，拔出引导针。将弯头针拉近纤维环部位，然后重新向前进入髓核内直至相同深度，重复3～5次。

3.猪椎间盘影像学检查

在猪进行造模前、造模后1个月、手术后1个月分别进行MR检测，观察椎间盘状态，每次行MR检查均将猪进行全麻，并监测生命体征。进行MR后密切观察猪的饮食及二便3天，一切均正常后，进行统一饲养。并运用P fi rrmann分级系统对椎间盘进行评估[6]。

4.标本采集与检测

2个月后，三组猪颈动脉放血处理，游离相对应椎间盘，取出纤维环，放于-80℃冰箱保存，采用Western Blot方法检测APQ-3的表达，另取椎间盘组织(每只猪取L2-3、L3-4、L4-5、L5-6共4个椎间盘)，连同上、下部分椎体，固定于甲醛，脱钙行组织切片，片厚5 μm。常规苏木精-伊红染色。所有椎间盘组织标本用10%甲醛常规固定，椎间盘EDTA液脱钙,经脱水、透明、包埋，连续5μm横断面切片，其中一片HE染色，观察每个正中矢状面椎间盘，并留影。

5.统计学分析

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，实验数据以均数±标准差(±SD)表示，组间比较采用单因素方差分析，组内比较采用重复测量设计的方差分析，两变量间相关性分析用Person相关分析，以P ＜ 0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.影像学观察

如图1所示，在Con组椎间盘纤维环呈中等信号，髓核呈高信号影,纤维环信号略有不均匀，局部呈低信号影；在Mod组椎间隙变窄，椎间盘后突，硬膜囊受压，髓核信号基本丧失，椎间盘变形；在Las组脊柱形态也出现了一定的退行性改变，髓核呈中高信号，间盘出现一定的形变，信号有部分缺失，部分区域呈低信号影，但基本完整，由于造模过程中对组织损伤较大，部分椎体高度发生明显变化。

影像学分级结果如表1所示， 通过表1椎间盘影像学分级统计得出结果。Con组中的MR影像均为Ⅰ-Ⅱ级，未见明显的退变征象；Mod组中主要以Ⅲ-Ⅳ级为主，可见明显的退行性改变；Las组以Ⅱ-Ⅲ级为主，退变轻； Con组椎间盘的Ⅰ、Ⅱ级总数为100%、Mod组Ⅰ、Ⅱ级总数为16.7%、Las组Ⅰ、Ⅱ级总数为58.3%。

2.猪椎间盘组织形态学变化

肉眼观察椎间盘组织可发现，Con组椎间盘未见明显退变,髓核呈白色胶冻状、含水量多,结构清晰，纤维环与髓核之间有较为明显的分界，纤维环结构清楚、呈同心圆样排列，Thompson分级为I级；而Mod组的椎间盘可见明显的退化征象，纤维环局部出现明显破裂带，可见一个瘢痕样针刺通道,贯穿整个纤维环及髓核，周围出现硬化，Thompson分级分划分至Ⅲ-Ⅳ级；Las组椎间盘厚度下降,间质成分有所减低，髓核颜色为灰白色，纤维环与髓核之间分界略模糊，髓核周围出现白色纤维样组织，Thompson分级为Ⅱ-Ⅲ级(见图2)。

HE染色显示：Con组椎间盘组织结构较清晰，软骨基质丰富，走形清楚，排列有序，细胞众多，胞核较小，呈圆形，位于中央,纤维环结构正常；Mod组组织结构紊乱，胶原纤维变大、走形不规则，并有炎性始终及坏死，纤维增粗，并出现玻璃样变性，髓核细胞减少，纤维排列紊乱，分层不清晰，胶原纤维重度扭曲,部分断裂。细胞数目明显减少，胞核增大，细胞介于软骨细胞和纤维细胞；Las组髓核内部可见裂隙,细胞形态发生改变,细胞结构尚清晰，排列出现轻微的紊乱，细胞数中等，胞核与胞浆比例基本正常，并伴有轻微的炎性坏死及渗出(见图3，表2)。

图1 各组小型巴马猪椎间盘MR检测结果Fig.1 MRI results of intervertebral discs of Bama miniature pigs

表1 椎间盘影像学分级统计表Table 1 Intervertebral disc imaging grading table

表2 三组猪椎间盘病理分级表Table2 Pathological grading table of three groups of porcine intervertebral disc

图2 三组小型巴马猪间盘大体病理改变Fig.2 Gross pathological changes of plate among the three group

图3 三组巴马小型猪椎间盘病理组织学变化 HE染色Fig.3 Histopathological changes of intervertebral discs in three groups of Bama miniature pigs by HE staining

3.间盘纤维化AQP-3表达的变化

如图4所示，细胞浆染为棕黄色或棕褐色为阳性表达。Con组间盘切片有明显阳性表达,细胞浆被染为棕黄色或棕褐色；Mod组几乎无阳性颗粒，结构紊乱；Las组可见部分表达染色明显减弱，阳性细胞数目较Con组明显减少，但明显多于Mod组。

4.Western Blot检测结果显示

与Con组比较，Mod组和Las组的AQP-3表达明显减弱，差异有统计学意义(P ＜ 0.05)；与Mod组比较，Las组的AQP-3表达显著增加 (P ＜ 0.05，见图5)。

WB结果显示，对照组(Con组) AQP-3的表达明显较造模组(Mod组)及激光组(Las组)显著升高(P ＜ 0.05)。AQP-3在Mod组WB的表达较弱，条带较窄；与Mod组相比，Las组的表达显著升高 (P ＜ 0.05)。

图4 三组小型巴马猪椎间AQP-3免疫组化变化Fig.4 AQP-3 change among three group

图5 三组巴马小型猪椎间盘AQP-3 WesternBlot结果Fig.5 Western Blot Results of AQP3 in three groups of Bama miniature pig intervertebral discs*P ＜ 0.05，与 Mod 组及 Las组比较；#P ＜ 0.05，与 Mod组度比较

讨 论

近年来， AQPs在间盘细胞水及营养物质的转运越来越被大家所认同。AQPs是一种小分子疏水性跨膜蛋白，大小约为26-34 kD,可选择性通透水，广泛存在于动、植物及微生物中。由于成人椎间盘缺少血液供应，软骨终板和纤维环的AQPs可能在椎间盘营养供应和代谢过程中起重要作用。Richardson等[3]研究发现在人纤维环及髓核中有AQP-1、AQP-3的表达,而无AQP-2表达,在外层纤维环中有少量的AQP-3表达而无AQP1表达,原野等也在退行性变的椎间盘中发现AQP-3的表达明显低于正常的椎间盘组织[7,8]。

椎间盘内正常流体力学功能丧失是启动椎间盘退变的共同通路,间盘所承受的压力负荷不断变化，其内水分的含量也随压力的改变而改变，液体的转运对间盘的弹性异常重要。正常间盘在不断活动中产生形变，所以水份进出间盘的速度也很快。纤维环为致密的环状结构，单纯弥散不足以解释这一生理现象。国内外研究发现椎间盘中有AQPs的表达，AQPs在椎间盘维持脊柱稳定、缓冲和均匀分配中发挥重要作用[9～13]。

目前治疗椎间盘突出比较成熟方法是通过椎间盘微创技术对突出部分切除或者通过高温热凝技术将突出的髓核进行消融。虽说暂时解决了突出压迫的问题，但可能对椎间盘造成不可逆的损伤，难以保证长期效果，低能激光这项技术的独创性在于，它不追求在椎间盘中建立所谓的一般认为在负压作用下“突出体组织”会向之移动的“储备腔”，取而代之的是在椎间盘中形成总体积小于椎间盘体积1%的若干细小渠道。通过多通道激光穿刺椎间盘重构修复术使用0.97 μm波长的辐射，减小了对椎间盘的破坏，又对突出的髓核进行治疗，通过多通道激光穿刺椎间盘重构修复术，可以显著地扩大经皮激光穿刺治疗腰椎间盘源性疾病的适应症范围，并最大程度上不损伤椎间盘本身的结构[14,15]。

本实验通过小型巴马猪来模拟临床病人，制成与临床相似的椎间盘退变模型。穿刺造模后1个月进行MR检查，发现进行穿刺的椎间盘出现间隙变窄，椎间盘后突，硬膜囊受压，髓核信号缺失，纤维环变形等改变，按照P fi rrmann分级标准，处理后的椎间盘在Ⅲ-Ⅳ级，提示造模成功。在造模成功1个月后，进行低强度激光治疗，结果显示，治疗组椎间盘MRI P fi rrmann分级较模型组明显降低，大体标本和HE染色结果也证实治疗组椎间盘退行病变明显减轻，提示低强度激光对椎间盘具有一定修复功能，并且低强度激光是通过生物波的形式，刺激周围组织，在治疗的过程中相对减少了对周围椎间盘的破坏作用。

本研究结果显示，模型组免疫组化示间盘切片几乎无黄染颗粒。Las组阳性细胞数目明显多于模型组，Wester检测结果也显示，激光治疗组的AQP-3明显增加。

本研究中获得的标本均是手术摘除的椎间盘组织，由于初次进行椎间盘解剖，相对操作不是非常规范,肉眼较难分辨出椎间盘各个组织，在取材过程中可能会破坏周边组织造成实验误差，加之样本量相对不足，所以对同一头猪的同一脊柱多次取材。这样可能会从某种程度上影响实验结果。

综上所述，低强度激光修复术可通过生物波进行治疗，对退变的椎间盘具有一定的保护和修复作用，其机制与上调水通道蛋白-3有关。

[1]Kageyamay, Sasaki S, Yamawra Y, et al. Water channel protein subtype suggests the origin of RCC. J Urol,1996, 156:291 ～ 295.

[2]李学军.水通道的生物学研究.生命科学, 2003,15(6):383 ～ 390.

[3]Richardson SM, Knowles R, Maples D, et al. Aquaporin expression in the human intervertebral disc, J MolHist,2008, 39(3):303 ～ 309.

[4]Badaut J, LasbennesF, Magistretti PJ, et al. Aquaporins in brain: distribution, physiology,and pathophysiology.J Cereb Blood Flow Metab, 2002, 22(4): 367 ～ 378.

[5]曹国永,周跃,滕海军,等.水通道蛋白在正常大鼠椎间盘组织中的表达与分布.中国矫形外科志,2005, 13(13):996 ～ 999.

[6]Sehulm DS, Rodriguez AG, Hansma PK, et al. Mechanieal Profiling of inter Vertebral dises. Biomech,2009, 42(8):1154 ～ 1157.

[7]李书忠,陈培動,胡有谷.正常椎间盘胶原的研究.生物化学杂志, 1993, 9(2):184 ～ 189.

[8]原野,赵静,李永民,等.核因子κB、基质金属蛋白酶3.在退变腰椎间盘组织中的表达.中国组织工程研究与临床康复, 2011, 15(22):4111 ～ 4114.

[9]曹国永,周跃,滕海军,等.水通道蛋白在正常大鼠椎间盘组织中的表达与分布.中国矫形外科杂志2005, 13(13):996 ～ 999.

[10]曹国永,杨渝勇,蒋勇,等.椎间盘退变过程中软骨终板AQP3的表达变化.重庆医学, 2011, 40(4):359 ～361.

[11]张乐颖,王加启,卜登攀,等.水通道蛋白研究进展.中国畜牧兽医, 2008, 35(11):40 ～ 43.

[12]李健,朱豪东,颜登鲁,等.水通道蛋白3在人正常椎间盘中的表达.中华实验外科杂志, 2008, 25(6):790 ～ 791.

[13]张永涛. AQP-1、AQP-3在椎间盘退变中的作用.云南:大理学院, 2010.

[14]Eliott DM, Sarver JJ. Young investigator award winner validation of the mouse and rat disc as mechanical models of the human lumbar disc. Spine, 2004,29(7):713 ～ 722.

[15]TC Y, Liu SH. Biophotonics on low intensity laser.Chinese Journal of Laser Medicine& Surgery, 1997,6(3): 125 ～ 131.

THE INFLUENCE OF LOW-INTENSITY LASER ON THE EXPRESSION OF AQUAPORIN-3 IN DEGENERATIVE DISC OF THE MINIATURE BAMA PIG*

HUANG Ming1#, SUN Ying-Jie1#△, ZHANG Tie-Zheng1, LI Kai2, ZHENG Hao-Long1, HE Bao-Wen1,CHEN Ke-Yan1
(1Department of Anesthesia, General Hospital of Shenyang Military Command Area，Shenyang 110031,China;2Department of Anesthesia, NO.4 Hospital of Shenyang, Shenyang 110031, China)

Objective:To investigate the effect of low intensity laser irradiation on porcine intervertebral disc aquaporin-3 (AQP-3) expression by constructing the miniature Bama pig degenerative disc model. Methods: Nine miniature Bama pigs were randomly divided into three groups: control group (Con), model group (Mod) and laser treatment group (Las). Con group did not undergo any treatment, while the Mod group and the Las group underwent Type C arm X-ray guidance puncture with 16G needles to break down the L2-3, L3-4, L4-5, L5-6intervertebral discs. After one month, the discs were treated with low-energy laser treatment for another month. MR imaging was performed for 1 month. The expression of AQP-3 was detected by HE staining, immunohistochemistry and Western blot.Results:The T2-weighted images of the intervertebral discs showed a high signal intensity in the three groups before modeling, one month after modeling and one month after treatment. The signal intensity of the Mod group decreased significantly, and the signal intensity in the Las group was moderate and high compared with the Mod group.The structure of Con group was damaged and the structure of Las group was restored compared with Mod group.Compared with Con group, the expression of AQP-3 was signi fi cantly decreased in Mod and Las groups (P ＜ 0.05),but the expression of AQP-3 in Las group was signi fi cantly higher than Mod group (P ＜ 0.05) . Conclusion: Low intensity laser has a protective effect on degenerated intervertebral disc of Bama miniature pig, and its mechanism is possibly related to the up-regulation of aquaporin expression.

Low intensity laser; Intervertebral disc degeneration; Bama miniature pigs; AQP-3

10.3969/j.issn.1006-9852.2017.10.004

沈阳市科技计划项目(No：F14-158-9-11)

#共同第一作者

△通讯作者 sunyingjie9@hotmail.com